响应面法优化微波辅助提取红皮云杉多酚工艺

周 芳，赵 鑫，宫 婕，刘海鹏，王振宇

（1.东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨150040；2.哈尔滨工业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150090；3.黑龙江省质量监督检测研究院，黑龙江哈尔滨150020）

红皮云杉（Picea koraiensis Nakai）是松科云杉属常绿乔木，分布于大、小兴安岭、完达山及张广才岭，吉林长白山等地。松属植物中含有萜类、多酚类、生物碱等多种生物活性成分[1]，具有抗氧化、抗病毒及抗菌等生物活性[2-3]。植物多酚广泛存在于植物体的叶、木、皮、壳和果肉中，许多针叶树皮中植物多酚含量高达20%～40%[4]。近年来研究表明，多酚具有抗心脑血管疾病、抗衰老、清除自由基、抗癌、抗辐射等多种生理功能[5-9]，可应用于食品、医药、精细化工等领域。这类物质来自于天然植物，基本上不存在毒副作用，在日本有人将其称为第七类营养素。

微波辅助萃取技术是近年来发展起来的提取方法，与传统提取方法相比，具有高效、快速、节能、污染小、质量稳定等优点，特别适合于处理热敏性组分或从天然物质中提取有效成分，己被应用于植物成分的提取[10-12]。目前，采用微波辅助萃取技术提取红皮云杉多酚的研究尚未见报道。本文以红皮云杉球果为原料，采用微波辅助提取法从中提取多酚，并通过响应面法优化其提取工艺，建立回归模型，可用于预测红皮云杉多酚得率。本文研究成果为红皮云杉多酚的深入研究和工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红皮云杉球果 采自长白山；无水乙醇、石油醚 天津市富宇精细化工有限公司；无水碳酸钠 天津市恒兴化学试剂制造有限公司；没食子酸 Sigma公司；福林酚试剂 天津市东丽区天大化学试剂；所用化学试剂 均为分析纯。

高速万能粉碎机 天津泰斯特仪器公司；T6紫外可见分光光度计 北京普析通用公司；XH-300A超声微波联合萃取仪 北京祥鹄科技发展有限公司；NDJ-1电热恒温水浴锅 北京医疗电子仪器厂；电子天平 上海精天电子仪器厂；TDL-5台式离心机 上海科兴仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 多酚提取工艺过程 红皮云杉球果→干燥→粉碎（40目）→除脂→干燥→微波辅助提取→离心→取上清液→定容并测量吸光度→计算多酚得率。

1.2.2 标准曲线的绘制 分别准确量取没食子酸标样溶液（100μg/mL）0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35mL于10mL比色管中，加蒸馏水至2mL，摇匀后加入1.0mL福林酚试剂，4min后加入1.0mL 10%的碳酸钠溶液，25℃水浴下保持2h后，在765nm处测定吸光度值，得标准曲线回归方程为：y=0.0214x+0.0033，R2=0.9992。

1.2.3 红皮云杉多酚得率的测定 采用福林酚法[13]。准确吸取1mL红皮云杉球果提取液于10mL比色管中，加蒸馏水至总体积为2mL。加入1.0mL福林酚试剂后摇匀，4min后加入1.0mL 10%碳酸钠溶液，25℃水浴下保持2h后，在765nm处测定吸光度值。将吸光度值代入标准曲线方程，按下式计算样品中多酚的得率：

式中：Y—多酚得率（%），A—吸光值，b—标准曲线截距，N—稀释倍数，V—溶剂体积（mL），a—标准曲线斜率，M—红皮云杉球果粉末质量（g）。

1.2.4 单因素实验 通过单因素实验，分别考察料液比、乙醇浓度、提取时间、微波功率对红皮云杉多酚得率的影响。每个实验条件重复3次，取平均值。

1.2.4.1 料液比对多酚得率的影响 精确称取6份2.00g的红皮云杉球果粉末，在乙醇浓度为40%、微波功率为200W、提取时间为40s的条件下，料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）。

1.2.4.2 乙醇浓度对多酚得率的影响 精确称取6份2.00g的红皮云杉球果粉末，在料液比为1∶20、微波功率为200W、提取时间为40s的条件下，乙醇浓度分别为0%、20%、40%、60%、80%、100%。

1.2.4.3 提取时间对多酚得率的影响 精确称取6份2.00g的红皮云杉球果粉末，在料液比为1∶20、乙醇浓度为40%、微波功率为200W的条件下，提取时间分别为10、20、30、40、50、60s。

1.2.4.4 微波功率对多酚得率的影响 精确称取6份2.00g的红皮云杉球果粉末，在料液比为1∶20、乙醇浓度为40%、提取时间为40s的条件下，微波功率分别为100、200、300、400、500、600W。

1.2.5 响应面法实验设计 在单因素实验的基础上，以料液比、微波功率、提取时间三个因素为自变量，以多酚得率为响应值，采用Box-Behnken设计法优化多酚提取工艺条件，分析软件为Statistica 6.0。设计三因素三水平响应分析实验，中心点实验重复5次，实验的因素水平编码见表1。

表1 响应面分析因素和水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3 数据处理

采用Excel软件对实验结果进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 微波功率对多酚得率的影响 由图1可知，在微波功率为100～300W时，随着微波功率的增加，多酚得率明显增加，且明显呈正相关关系，在微波功率为300W时，多酚得率最高；在微波功率为300～500W时，多酚得率明显下降，且基本呈负相关关系。这是由于随着微波功率的增加，其产生的热效应随之增大，有利于多酚的溶出，表现为得率明显增加。但是在功率超过300W后，溶剂中大量的水分子产生的热效应使溶液温度升高过快，加速了多酚的降解，多酚损失较大，因而多酚得率有所下降。因此，选择微波功率为300W。

图1 微波功率对多酚得率的影响Fig.1 Effect of microwave power on the yield of polyphenol

2.1.2 料液比对多酚得率的影响 由图2可知，在料液比在1∶10～1∶30g/mL时，随料液比的增加，多酚得率随之增加，且呈明显正相关关系，在料液比为1∶30g/mL时，多酚得率最高；在料液比为1∶30～1∶60g/mL时，随溶剂量的增加，多酚得率有所下降。这是由于增加浓度梯度可增加提取效果，提高料液比对有利于多酚的提取，但当料液比达到某一限度时，再提高溶剂量则相当于对多酚溶液的稀释，降低了浓度梯度，同时，更多的溶剂也可能消耗了微波的能量，所以多酚得率反而有所下降。因此，选择料液比为1∶30g/mL。

2.1.3 乙醇浓度对多酚得率的影响 由图3可知，在乙醇浓度为0%～40%时，随着乙醇浓度的增加，多酚得率随之增加，且明显呈正相关关系，乙醇浓度为40%，多酚得率最高；随着乙醇浓度继续增加，多酚得率明显下降，这可能是因为乙醇浓度为40%时，与红皮云杉多酚的极性最为相近，多酚的溶解度最大。因此，选择乙醇浓度为40%。

图2 料液比对多酚得率的影响Fig.2 Effect of the ratio of material to liquid on the yield of polyphenol

图3 乙醇浓度对多酚得率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on the yield of polyphenol

2.1.4 提取时间对多酚得率的影响 由图4可知，在提取时间为10～40s时，随着提取时间的增加，多酚得率明显增加，且基本呈正相关关系；在提取时间为40～60s时，多酚得率增加缓慢，在提取时间为40s时基本达到多酚得率的最高值，在提取时间为40～60s时，多酚得率增加缓慢，提取量已基本达到饱和，并且得率没有随着提取时间的增加而出现下降的趋势，这说明微波的热效应在提高多酚得率的同时，并没有明显加速多酚的降解。因此，选择提取时间为40s。

图4 提取时间对多酚得率的影响Fig.4 Effect of extraction time on the yield of polyphenol

2.2 响应面法优化提取工艺条件

2.2.1 响应面实验设计及结果 根据Box-Behnken实验设计原理，在单因素实验的基础上，选择料液比、微波功率、提取时间3个因素，进行三因素三水平的响应面实验设计，共17个实验点，实验结果见表2。

表2 响应面实验设计及结果Table 2 Response surface experimental design and the result

2.2.2 数学模型的建立及显著性检验 对所得数据进行多元回归拟合，方差分析结果见表3，得到的回归模型为：Y=17.1900+0.5038X1-0.1312X2+0.9850X3+ 0.0325X1X2+0.0550X1X3-0.0950X2X3-2.2438X12-1.6937X22-0.8513X32。

由表3可知，回归模型的显著性水平p＜0.0001，达到极显著水平；失拟项p=0.052＞0.05，差异不显著，且相关系数R2=0.9945，表明实测值与预测值高度相关。综上所述，建立的回归模型拟合度高，可用该模型较好地描述各因素与响应值之间的真实关系。因此，可用该模型预测微波辅助提取红皮云杉多酚的工艺条件。

表3 回归模型方差分析Table 3 The variance analysis of regression model

回归模型显著性检验结果见表4。t检验结果表明，料液比、提取时间的一次项和二次项、微波功率的二次项对多酚得率的影响极显著，而微波功率的一次项和交互项对多酚得率的影响不显著。各因素对多酚得率影响程度大小顺序为：X3（提取时间）＞X1（料液比）＞X2（微波功率）。

表4 回归模型显著性检验Table 4 The significance test of regression model

图5 料液比和微波功率对多酚得率影响的响应面图Fig.5 Response surface plot for the effect of ratio of material to liquid and microwave power on the yield of polyphenol

图6 料液比和提取时间对多酚得率影响的响应面图Fig.6 Response surface plot for the effect of ratio of material to liquid and extraction time on the yield of polyphenol

2.2.3 响应面优化与验证实验 利用Statistica 6.0软件，绘制各因素对红皮云杉多酚得率影响的响应曲面和等高线图，结果见图5～图7。如果一个响应曲面的坡度较平缓，表明随着处理条件的变化，响应值变化较小；而如果一个响应曲面的坡度较陡峭，表明随着处理条件的变化，响应值变化较大。

图7 微波功率和提取时间对多酚得率影响的响应面图Fig.7 Response surface plot for the effect of microwave power and extraction time on the yield of polyphenol

由图5～图7可知，料液比与微波功率、料液比与提取时间、微波功率与提取时间等两两因素的交互作用呈现出山丘形或马鞍形曲面，表明各交互作用对响应值有明显影响，并且3个等高线中最小椭圆的中心都在各因素值-1～+1范围内，说明响应值的最大值在3个因素设计的范围内。从等高线的疏密度可以判断出，料液比对响应值的影响大于微波功率、提取时间对响应值的影响大于料液比、提取时间对响应值的影响大于微波功率。

综上所述，提取时间对多酚得率的影响最大，料液比次之，微波功率的影响相对较小。通过计算，得到的最佳工艺条件为：料液比为1∶31.19、微波功率为294.6W、提取时间为45.85s。在此条件下，红皮云杉多酚的得率为17.51%。考虑到实际操作条件，将工艺条件修正为料液比1∶31、微波功率295W、提取时间46s。在此条件下，进行验证实验，实际测得的得率为17.38%，实测值与预测值相对误差＜1%，说明回归模型拟合度高，可用于优化微波辅助提取红皮云杉多酚的工艺条件，具有实用价值。

3 结论

本实验在单因素实验的基础上，采用响应面分析法对微波辅助提取红皮云杉多酚的工艺条件进行了优化。结果表明，料液比、提取时间对红皮云杉多酚得率均有显著影响，最佳工艺条件为：料液比1∶31、微波功率295W、提取时间46s，乙醇浓度40%。验证实验结果表明，回归模型拟合度高，得率可达到17.38%，可用于优化微波辅助提取红皮云杉多酚的工艺条件，具有实用价值。

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