NK细胞杀伤弓形虫的机制及中药的调节作用

吴 丹，肖蓓蕾，李晓东，王斐然，杨漠源，王伟强

（河北大学医学部，河北 保定 071000）

NK细胞杀伤弓形虫的机制及中药的调节作用

吴 丹，肖蓓蕾，李晓东，王斐然，杨漠源，王伟强

（河北大学医学部，河北 保定 071000）

NK 细胞的杀伤活性无 MHC 限制，不依赖抗体，其靶细胞主要是某些肿瘤细胞、病毒感染细胞、某些自身组织细胞、寄生虫等，所以在抗细胞内弓形虫感染的免疫应答中起重要作用，将影响 NK 细胞杀伤弓形虫活性的中药成分以及NK 细胞杀伤弓形虫的机制等进行综述。

弓形虫；NK细胞；感染；中药成分；杀伤

刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种机会性的专性胞内寄生原虫，能够引起人兽共患病。弓形虫的生活史十分复杂，猫和其他猫科动物是其终末宿主，其他温性动物包括人类都可以成为弓形虫重要的中间宿主[1]。主要通过侵入中间宿主肠壁经血或淋巴进入单核-吞噬细胞系统的细胞内寄生，进而感染全身其他部位且入侵有核细胞，造成严重破坏。机体的免疫系统通过固有免疫和获得性免疫来防御感染，其中固有免疫中的自然杀伤细胞（natural killer, NK）是抗感染的重要一方面。

自然杀伤细胞是机体执行固有免疫的主要细胞，是天然免疫的主要承担者,对病原体感染和恶性转化的细胞具有自然细胞毒效应。NK 细胞无需抗原预先致敏即可以直接杀伤靶细胞[2]，所以，NK 细胞作为生物治疗的新手段越来越受关注。

1 NK细胞杀伤弓形虫的机制

1.1 线粒体介导的凋亡途径

颗粒溶素（granulysin，GNLY）是细胞毒颗粒蛋白，与穿孔素和颗粒酶共同定位于人的细胞毒 T 淋巴细胞（CTL）和NK细胞溶细胞颗粒中，近来发现 GNLY 也释放到外周血浆中[3]。GNLY 具有广谱抗病原菌、真菌和寄生虫的效应，不仅能直接杀伤胞外致病菌，还可在穿孔蛋白（perforin）的协同作用下降低胞内病原菌的生存能力[4]。在弓形虫感染中，颗粒溶素-B 能够直接作用于凋亡酶促进凋亡[3]。王伟灵等[5]发现，GNLY 电荷形成与细胞膜相互作用有关。GNLY 带正电荷与带负电荷的细胞结合，导致胞内 Ca2+浓度的增加和 K+浓度的降低，神经磷脂酶被激活，神经酰胺浓度缓慢增加，通过更快速的过程，线粒体被损伤，线粒体膜通透性增高，细胞色素 C 和诱导凋亡的因子被释放，导致 caspase 和核酸内切酶被激活，发生细胞凋亡。Walch 等[6]还发现在穿孔素存在下，颗粒溶素依赖的细胞溶解作用加强。也就是说两者相互协同损伤细胞。依赖于穿孔素（PFP）或其他孔形成蛋白所形成的活性孔道，GNLY 可进入靶细胞内杀灭寄生的病原微生物[7]。弓形虫不同于其他大多数细胞内寄生病原体，几乎可以感染所有各种类型细胞。弓形虫从入侵部位进入血液后散布全身并迅速进入单核-巨噬细胞以及宿主的各脏器或组织细胞内繁殖，直至细胞胀破，逸出的原虫（速殖子）又可侵入邻近的细胞，当机体感染弓形虫后，GNLY 可以通过线粒体介导的凋亡途径，杀伤弓形虫感染的宿主细胞，还可以在穿孔素的协助下，即穿孔素在寄生有弓形虫靶细胞细胞膜上形成多聚穿孔素“孔道”，水电解质入胞致其裂解，GNLY 循“孔道”入胞，激活凋亡相关酶系统致靶细胞凋亡。

1.2 Fas/FasL 途径

弓形虫感染，引起组织中细胞凋亡相关蛋白 Bax、Bcl-2、Fas、FasL 及 TNF-α表达增加[8]。Fas 分子胞内段有死亡结构域（death domain, DD） ，三聚化的 Fas 和 FasL 结合后，使 3 个 Fas 分子的 DD 相聚成簇，吸引了细胞质中另一种带有相同 DD 的 Fas 相关死亡结构域蛋白（Fas-associated death domain, FADD）。FADD 是死亡信号转录中的一个连接蛋白，它由两部分组成：C 端（DD结构域） 和 N 端（死亡效应结构域，death effector domain, DED） 部分。C 端负责与 Fas 分子胞内段上的 DD 结构域结合，该蛋白再以 DED连接另一个带有 DED 的后续成分[9]。活化的 NK 细胞可表达 FasL，Fas（CD95）通过与其特异性配体FasL（ CD95L） 结合而在细胞膜表面发生聚合，形成的复合物通过FADD与Caspase28特异的结构域结合，并使Caspase28形成二聚体而自身激活，进而引起细胞的Caspases酶系级联反应，引起多种死亡性底物的酶解而引发DNA降解，使凋亡发生，导致靶细胞凋亡[10]。凋亡信号激活半胱天冬酶后，caspase-3水解半胱天冬酶激活的Dnase抑制因子，释放的caspase-3水解半胱天冬酶激活的Dnase进入核内，发挥Dnase活性降解染色体DNA，导致靶细胞解体[11]。其作用包括以下 3 个方面：（1）凋亡信号传导级联反应过程的一个关键环节；（2）可直接破坏细胞结构，如核层蛋白（Laminine） 和凝胶蛋白（ Gelsolin） 等，使蛋白分解引起凋亡；（3）对蛋白酶的调节功能，如灭活细胞凋亡的抑制剂作用、激活下游的核酸内切酶等[7]。感染弓形虫时，通过 NK 细胞活化，引起细胞的Caspases酶系级联反应，导致弓形虫感染的靶细胞细胞结构破坏，染色体 DNA 降解，使靶细胞解体，实现 NK 细胞对弓形虫的杀伤。而一项关于 Fas-AD 诱导 Bel-7402细胞凋亡的研究[12]表明：除 caspase-8外，P38MAPK 也参与了此凋亡过程，而且二者在 mRNA 水平上相互调节。

还有研究表明，Fas/FasL还可以通过第二信使的途径来诱导凋亡。Fas/FasL结合时，鞘磷酸脂酶活化，从而使鞘磷酸分解生成神经酰胺，然后通过胞质内丝/苏氨酸蛋白磷酸激酶和膜结合性的丝/苏氨酸蛋白激酶导致 IP3 和 DAG 等第二信使激活，胞内 Ca2+浓度升高，从而激活 Ca/Mg 依赖的核酸酶，使DNA 断裂，激活谷氨酰胺转移酶，使胞质内蛋白分子发生交联，从而导致细胞凋亡[13]。

1.3 TNF-α/TNF-R1途径

弓形虫感染妊娠中期的小鼠，可引起胎盘组织中细胞凋亡相关蛋白表达量的改变，进而启动内、外源性的细胞凋亡途径，导致胎盘细胞凋亡增加[14]。NK 细胞表面能恒定地表达 TNF，TNF 与受弓形虫感染的细胞表面的 TNF-R1结合后，TNF-R1 的 DD 与 TNFR相关死亡结构域蛋白（TNF receptor．asso—ciated death domain）分子的 DD 交联，后者作为一种辅助因子与 FADD 结合后可通过和 Fas-FasL 相同的途径诱导细胞凋亡。活化的 NK 细胞可释放 TNF-α 和 TNF-β（LT），TNF 通过（1）靶细胞溶酶体的稳定性发生变化；（2）影响细胞膜磷脂代谢；（3）糖代谢发生变化，组织中 pH 降低（pH6.5 的培养条件较适于试验的弓形虫速殖子体外增殖）；（4）靶细胞核酸内切酶活化，降解基因组 DNA 从而引起程序性细胞死亡等机理杀伤靶细胞[9]。TNF 引起细胞死亡过程要明显慢于穿孔素溶解细胞的作用。

2 影响 NK 细胞杀伤弓形虫活性的中药成分

2.1 单味中药成分大蒜素

徐丽等[15]应用不同浓度的大蒜素对体外培养的大鼠脾 NK 细胞进行处理，结果发现大蒜素能改变 NK细胞S+G2/M周期比例，且在大蒜素的一定浓度范围内，对 NK 细胞增殖率的影响呈剂量依赖关系，即在相同的培养时点 NK 细胞的增殖率随大蒜素使用浓度增高而升高，提示大蒜素可提高 NK 细胞活性，30 mg/L是大蒜素的相对适宜浓度。大蒜素对 NK 细胞培养上清中 INF-γ 分泌水平的影响，与 NK 细胞的杀伤活性的变化趋势完全一致，大蒜素可能通过上调 NK 细胞分泌 INF-γ 的水平杀伤弓形虫。陈光等[16]采用台盼兰着色法观察大蒜素对弓形虫速殖子活性的影响，发现在大蒜素作用后，弓形虫速殖子的形态发生了显著的改变，虫体变短变粗，结构模糊，最终可能导致虫体破裂。采用 TUNEL 末端标记法检测弓形虫速殖子的凋亡率发现：大蒜素能够使弓形虫速殖子凋亡，并呈时间和剂量依赖性。而且大蒜还有免疫激活作用，大蒜素中有一种重要生物活性成分二丙烯基二硫化物，其活性基团是-os-s-基，可以刺激IL-2、TNF-α、IFN-γ释放，从而增强 NK 细胞杀伤活性[17-18]。

2.2 复合中药成分排毒增益汤

排毒增益汤也能提高 NK 细胞杀伤活性，苑文英等[19]发现：弓形虫感染模型组小鼠脾脏 NK 细胞杀伤率显著降低，可能与弓形虫感染小鼠免疫抑制有关，排毒增益汤各用药组对弓形虫感染小鼠脾脏 NK细胞杀伤率有显著上调作用，与模型组比较差异有统计学意义，说明排毒增益汤能促进弓形虫感染小鼠NK 细胞杀伤率，能够在抗弓形虫感染方面发挥作用。

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（责任编辑：高艳华）

The mechanisms of NK cells in killing Toxoplasma gondii and the role of traditional Chinese medicine in its regulation

WU Dan, XIAO Beilei, LI Xiaodong, WANG Feiran, YANG Moyuan, WANG Weiqiang
(Medical Center of Hebei University, Baoding 071000, China)

The killing activity of NK cells, whose main target cells are some tumor cells, cells infected by virus, tissue cells and parasites, etc, has no MHC restriction, and does not rely on antibody, so it plays an important role in the immune response to toxoplasma infection in cells. The following will review the Chinese herb ingredient which affects the activity of NK cells to kill toxoplasma and the mechanisms of NK cell in killing Toxoplasma gondii.

Toxoplasma gondii; NK cells; infection; Chinese native medicine ingredient; killing

R69

A

1674-490X(2014)01-0079-04

2013-09-23

吴丹（1990—），女，河北滦县人。E-mail: 595351510@qq.com