贻贝煮汁液酶解工艺的研究

罗伟，段振华，2，*，万斌，胡静

（1.海南大学食品学院，海南海口570228；2.海南大学热带生物资源教育部重点实验室，海南海口570228）

贻贝煮汁液酶解工艺的研究

罗伟1，段振华1，2，*，万斌1，胡静1

（1.海南大学食品学院，海南海口570228；2.海南大学热带生物资源教育部重点实验室，海南海口570228）

研究酶法水解贻贝煮汁液的工艺，以水解度和苦味分为指标，比较了1.398中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、复合蛋白酶水解贻贝煮汁液的效果，发现木瓜蛋白酶效果最好。在单因素试验基础上，以氨基酸态氮含量为响应值，通过Box-Benhnken试验设计及响应面分析法对影响煮汁液水解的主要因素进行工艺优化，确定贻贝煮汁液酶解最佳条件为：料水比1∶1.5（g/mL）、酶添加量0.76%、温度50.46℃、pH6.47、时间4 h，该条件下酶解液中氨基酸态氮含量为283.30mg/100mL。

贻贝煮汁；水解；木瓜蛋白酶；氨基酸态氮

贻贝俗称“海红”、“壳菜”、“淡菜”，是我国重要的养殖贝类之一[1]。贻贝肉鲜美可口，营养丰富，富含蛋白质，是一种集营养、保健、防病于一体的海产品，具有很高的食疗与药用功效。但在贻贝工业化加工过程中，经蒸煮预处理产生的汁液常常被作为废弃液排放，既污染环境，又浪费资源。贻贝蒸煮废弃液富含贻贝水溶性营养成分及生物活性物质。本实验主要研究贻贝煮汁液的酶法水解，旨在为酶技术应用于贻贝废弃液深加工生产高附加值的商品提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

贻贝煮汁液：海南椰岛（集团）股份有限公司提供；1.398中性蛋白酶（5×104U/g）：江苏锐阳生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（1.5×105U/g）：广西杰沃利生物制品有限公司；胰蛋白酶：ICN公司；复合蛋白酶（3.8× 105U/g）：丹麦Novo公司。

氢氧化钠、盐酸、浓硫酸、硼酸、硫酸钾、硫酸铜、酚酞、甲基红指示剂、溴甲酚绿指示剂、亚甲基蓝指示剂、95%乙醇、甲醛等试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

HH-S26S电热恒温水浴锅：金坛市大地自动化仪器厂；101-2型电热鼓风干燥箱：常州市华普达教学仪器有限公司；85-1恒温磁力搅拌器：金坛市富华仪器有限公司；BS124S电子天平：德国Sartorius公司；PHS-3C型实验室pH计：上海伟业仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 总氮量及氨基酸态氮测定

总氮量测定：参照GB5009.5—2010凯氏定氮法；氨基酸态氮测定：采用甲醛电位滴定法[2-3]。

1.3.2 水解度[4-5]

1.3.3 苦味评价

参照文献[6-8]方法。

1.3.4 单因素试验设计

参考酶的选择实验结果，选定木瓜蛋白酶继续试验，以氨基酸态氮含量为指标，进行单因素试验。试验设计为：加酶量（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%）、酶解温度（40、45、50、55、60℃）、酶解时间（2、3、4、5、6 h）、pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、料水比g/mL（1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3）。

1.3.5 响应面试验设计

在单因素试验基础上，利用响应面法（RSA）优化酶解工艺参数。其因素水平设计见表1。

表1 响应面分析因素与水平Table1 Factors and levels of the response surface tests

2 结果与分析

2.1 酶的选择试验结果

为了比较1.398中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、复合蛋白酶水解贻贝煮汁液的效果，以水解度和苦味值为指标，料水比（煮汁液与去离子水体积比）为1∶2（g/mL），酶的添加量为0.4%，在各酶最适作用条件下水解4 h，其最适作用条件根据文献[9-10]和初步试验确定，加热灭酶10min，4 000 r/min离心15min，取上清液分别进行水解度和苦味测定（用于苦味评定的上清液必须灭菌后进行品评）结果见表2。

表2 不同蛋白酶对贻贝煮汁液水解的影响Table2 Hydrolysis influence of different proteases

由表2可见，选用木瓜蛋白酶水解贻贝煮汁液时，蛋白质水解程度高于其他3种酶，且苦味分也较低。因此，决定采用该酶进一步试验。

2.2 木瓜蛋白酶的单因素试验

2.2.1 酶用量的选择

在温度为50℃，酶解时间为4 h，pH6.5，料水比为1∶2（g/mL）的条件下，加酶量不同，测得氨基酸态氮含量有所差别，见图1。

图1 加酶量对氨基酸态氮的影响Fig.1 The effect of amount of enzyme on amino acid-nitrogen（AA-N）

由图1可看出，当加酶量超过0.7%时，氨基态氮含量基本无明显升高。此结果可解释为酶用量在0.7%以下时，底物能被酶作用的位点过量，氨基态氮含量随酶用量的增加而逐渐升高；然而，当加酶量超过0.7%时，由于酶浓度已逐渐为底物所饱和的原因，导致氨基态氮含量随加酶量的增加而升高很小[11-12]。所以考虑成本等因素，木瓜蛋白酶添加量取0.7%为宜。

2.2.2 酶解温度的选择

在酶的添加量取0.7%，酶解时间为4 h，pH6.5，料水比为1∶2（g/mL）的条件下进行不同温度的选择，其水解效果不同，见图2。

图2 温度对氨基酸态氮的影响Fig.2 The effect of temperature on amino acid-nitrogen（AA-N）

由图2可看出，随着温度的升高氨基态氮含量呈先升后降的趋势，在50℃时氨基态氮含量达到最大值。因此，木瓜蛋白酶的酶解最适温度在50℃左右为宜。

2.2.3 酶解时间的选择

在酶加量为0.7%，酶解温度为50℃，pH6.5，料水比为1∶2（g/mL）的条件下，分别选择2、3、4、5、6 h进行酶解，见图3。

由图3可看出，在初期的1 h内酶解反应迅速，当水解进行3 h左右氨基态氮含量达到最大值；5 h后达到水解平衡，氨基态氮含量基本无明显变化。所以本研究选择水解时间为3 h。

图3 时间对氨基酸态氮的影响Fig.3 The effect of time on amino acid-nitrogen（AA-N）

2.2.4 酶解pH的选择

在酶加量为0.7%，酶解温度为50℃，时间为3 h，料水比为1∶2（g/mL）的条件下，分别将pH调节为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，测得氨基酸态氮含量的变化，见图4。

图4 pH对氨基酸态氮的影响Fig.4 The effect of pH on amino acid-nitrogen（AA-N）

图4表明，随着酶解pH的递增，氨基态氮含量呈先增后降的趋势，当pH达到6.5左右时，酶解液中氨基态氮含量达到最大值，这是因为pH会直接影响酶及蛋白质分子的某些解离基团的解离状态。只有在特定pH条件下，酶及底物蛋白质的解离基团才能处于易于结合并转化成产物的解离状态[8]。

2.2.5 料水比的选择

在酶加量为0.7%，酶解温度为50℃，时间为3 h，pH6.5的条件下，观察不同料水比对酶解效果的影响，见图5。

图5 料水比对氨基酸态氮的影响Fig.5 The effect of the raw material water on amino acid-nitrogen（AA-N）

由图5可知，当料水比为1∶1.5（g/mL）时酶解液中氨基态氮含量最高，1∶2时其含量略低，超过1∶2时氨基态氮含量下降较多。其主要原因可能为：酶解体系中加入适量的水，使底物在溶液状态下有效地与酶结合，从而产生更多氨基态氮；但底物浓度过小时，导致酶浓度降低，氨基态氮含量会下降，不利于反应进行。而且在生产上也不利于酶解液后期的浓缩等工艺要求[13]。所以综合考虑，选择料水比为1∶1.5（g/mL）进行研究。

2.3 响应面法优化试验结果与分析

试验设计及结果见表3。

表3 响应面试验设计及结果Table3 Designs and results of Box-Benhnken experimental（n=5）

方差分析及显著性比较结果见表4。

利用Design-expert7.0软件对数据进行回归分析，对各因素回归拟合，得到氨基态氮含量Y的回归方程Y=285.74+1.23X1-0.17X2+0.88X3-2.27X4-1.23X1X2+ 2.10X1X3-0.35X1X4+1.58X2X3-1.23X2X4+2.10X3X4-2.93X12-4.33X22+0.047 X32-4.68X42。同时，优化4个影响因素的最佳组合为：加酶量0.76%，酶解温度50.46℃，酶解时间4 h，pH为6.47，预测的氨基酸态氮含量为287.65mg/100mL。

表4 氨基酸态氮含量回归模型方差分析表Table4 Variance analysis of regression equation

由表4可以看出，所得Y的回归方程极显著，且失拟项不显著，说明此模型很理想，用方程Y拟合4个因素与氨基酸态氮含量是可行的。相关系数R2=0.989 6，表明回归方程与实际数据间具有较好的拟合性；R2Adj= 0.979 3，说明可信度较高。从因素X1、X2、X3、X4对氨基酸态氮含量的影响来看，除方程的一次项X2及二次项X32影响不显著外，其余因素影响均为极显著。通过比较方程一次项系数绝对值大小，可以判断因素影响的主次性[14]，本实验中因素间影响顺序依次为X4＞X1＞X3＞X2；交互项中除X1X4影响不显著外，其余因素间交互作用对氨基酸态氮含量均达到极显著（P＜0.01）影响，且各具体试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系，而是呈二次关系。

分别将模型中X1、X2、X3及X4其中2个因素固定在0水平，得到另外2个因素间交互作用对氨基酸态氮含量Y的子模型，图6～图9为4个因素间部分两两交互作用对氨基酸态氮含量影响的响应面分析图。

为了检验模型预测的准确性，在最佳酶解条件：加酶量为0.76%，温度50.46℃，时间4 h，pH为6.47时进行实验，测得氨基态氮含量为283.30mg/100mL，与预测值基本接近，表明预测值和真实值间有较好的拟合性，进一步验证了模型的可靠性。

图6 加酶量和温度对氨基酸态氮含量的影响Fig.6 The effect amount of enzyme and temperature on amino acid-nitrogen

图7 加酶量和时间对氨基酸态氮含量的影响Fig.7 The effect amount of enzyme and times on amino acidnitrogen

图8 加酶量和pH对氨基酸态氮含量的影响Fig.8 The effect amount of enzyme and pH on amino acidnitrogen

图9 温度和pH对氨基酸态氮含量的影响Fig.9 The effect temperature and pH on amino acid-nitrogen

3 结论

以贻贝煮汁液为原料，综合比较了1.398中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、复合蛋白酶酶解液的水解度和苦味评分，选择木瓜蛋白酶为目标用酶。在单因素试验结果基础上，利用响应面分析，建立了氨基酸态氮含量与加酶量、温度、时间、pH的二次多项回归模型，其各因素的主要效应关系为：X4（pH）＞X1（加酶量）＞X3（时间）＞X2（温度），并确定了最佳酶解条件：酶添加量0.76%、温度50.46℃、pH6.47、时间4 h，此工艺条件下测得平均氨基酸态氮含量为283.30mg/100mL，其与理论值间相对误差为1.51%。

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Study on Enzymatic Hydrolysis Technology of Mussel Boiled Liquor

LUO Wei1，DUAN Zhen-hua1，2，*，WAN Bin1，HU Jing1
（1.College of Food Science and Technology，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China；2.Key Laboratory of Tropical Biological Resources，Ministry of Education，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China）

Enzymatic hydrolysis of mussel boiled liquor was studied in this paper.Firstly，the effects of various enzymatic treatments with neutral protease，papain，trypsin and protamex on bitter taste value and degree of hydrolysis were compared，and the papain was found to be the best.Based on the result of single-factor tests，the amino acid-nitrogen content was chosen as the response values，then Box-Benhnken experimental design and response surface method were used to optimize technological conditions which is as follows：the material-to-water ratio1∶1.5（g/mL），enzyme addition amount of 0.76%，hydrolysis temperature of 50.46℃，hydrolysis pH of 6.47，hydrolysis time of 4h.Under such conditions，the content of amino acid-nitrogen reached283.30mg/100mL.

mussel boiled liquor；hydrolysis；papain；amino acid-nitrogen

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.03.011

2013-09-23

国家“十二五”科技支撑计划（2013BAB01B04）；海南省科技兴海专项（XH201308）

罗伟（1989—），男（汉），硕士研究生，研究方向：水产品食品科学技术。

*通信作者：段振华（1965—），男（汉），教授，博士，硕导，研究方向：水产食品科学技术。