清瘟败毒散对肉鸡耐药金黄色葡萄球菌的抑菌作用

耿梅英，苑方重，杨 倩，钟秀会

（河北农业大学动物医学院，河北 保定071000）

金黄色葡萄球菌(SA)是一种广泛存在于自然界的病原菌，人及多种动物均能感染发病，其中对肉鸡危害较为严重[1-2]。肉鸡发病后，临床表现为急性败血症、坏死性皮炎、关节炎、雏鸡脐炎、全眼球炎和骨膜炎，其中30～40日龄肉鸡发病最多，每年给养殖业造成巨大经济损失[1]。SA还可以产生多种引起急性胃肠炎的肠毒素（Staphylococcal en⁃terotoxins，SEs），包括A-E，F，G-I，R-T等20多种类型，可以引起机体中毒[3-6]；其中，SEA、SEB型可以结合MHCⅡ型抗原递呈细胞，并激活T细胞，是最典型的肠毒素，被称为超级抗原[6]。

相对于抗生素，中药方剂具有低药残留、无公害、不易耐药等优点，可作为肉鸡葡萄球菌病治疗的首要选择。很多研究表明，黄连、金银花、连翘等中药有良好的抗菌作用。本试验选用清瘟败毒散作为基本方剂进行加减，以黄连、金银花、连翘等抗菌中药为主药，配伍丹皮、黄芩、甘草等中药，辨证组方，用于治疗肉鸡葡萄球菌病的研究。

1 材料与方法

1.1 菌株与材料 金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923（中国医学微生物菌种保藏管理中心）；临床分离株S.aureus，分离自河北某地几家肉鸡养殖场，经却甫曼培养基纯化培养，及生化试验鉴定后保存应用（图1纯化培养的金黄色葡萄球菌）。Bradford蛋白定量试剂盒，购自北京研和翔试剂公司；SEA,SEB抗体，购自Sigma公司。0.22μm滤膜由北京卓信伟业科技有限公司供应。中药黄连、金银花、连翘等，购自保定万宝堂药房，组成试验方剂，合并后采用水煎浓缩方法，药物最终浓度为1 g/mL生药，试验用单味中药采用同样方法制备。

1.2 常用抗菌药物耐药性试验 将金黄色葡萄球菌标准株与分离株分别接种于普通平板培养基，选择链霉素、青霉素G、氨苄青霉素、阿莫西林、林可霉素、卡那霉素、恩诺沙星、四环素等8种常用抗菌药物的药敏纸片，进行药物敏感性试验，参考美国抗微生物药物敏感性判断标准CLSI[7-8]，判断药物对试验菌株的抑菌效果。

1.3 中药敏感性试验及MIC 试验中使用清瘟败毒散提取液，及组成该方的主要药物黄连、金银花、连翘、甘草、丹皮分别制成单药提取液。将细菌接种于普通营养琼脂培养基，采用挖洞注药法做药物平板抑菌试验。在已接种细菌的培养基上均匀打孔，将药注满孔，在4℃条件下放置2 h，然后于37℃培养24 h，使用卡尺测药物对该细菌抑菌环直径的大小，以确定药物对细菌的作用效果。

利用普通试管，做营养肉汤培养基，将清瘟败毒散提取液及单味中药提取液，均采用等比稀释的方法，做成浓度系列。浓度范围是1 g/mL～2-10g/mL生药，加入营养肉汤中，同时接种细菌，以不加药物的作空白对比，在37℃下培养24 h，观察含有药物的肉汤中细菌的生长情况，确定药物对细菌的最小抑菌浓度（MIC），判断标准参照CLSI标准M27-A3[8]。

1.4 清瘟败毒散对S.aureus肠毒素生成的影响

根据MIC试验结果，在接种试验菌株的LB培养基中MIC浓度的清瘟败毒散方剂提取液，并进行倍比稀释，以不添加药液的培养基做对照，37℃下培养24 h，收集各培养基菌液上清，取20μL，采用Western blot方法测定菌液中S.aureus肠毒素SEA、SEB。

2 结果

2.1 细菌耐药试验 参照标准，抑菌环直径大于20mm为超敏；抑菌圈直径在15mm～20mm，表现为高敏；抑菌圈直径在10mm～14mm，表现为中敏；抑菌圈直径小于10mm，表现为低敏；无明显的抑菌圈，表现为耐药。各分离株SA及标准株耐药状况如表1所示。临床分离的菌株林可霉素敏感性较高，对链霉素与四环素的耐受性普遍较强，其中大部分菌株出现耐药，药敏试验没有出现抑菌环；同时，各分离菌株对卡那霉素与氨苄青霉素敏感性较低，并且有菌株表现耐药；其他药物反应多表现中等程度的敏感。试验结果同时显示，临床分离的SA对常用抗菌药物敏感性差异较大。其中，编号SA9-7菌株对多种药物明显耐药。试验中，我们选择SA9-7做中药抑菌试验。

表1 金黄色葡萄球菌耐药性分析（抑菌环直径=mm）

2.2 中药敏感性试验及MIC 中药方剂清瘟败毒散及组成方剂的部分单味中药对临床分离菌株SA9-7及标准株ATCC25923的抑菌效果见表2。

表2 中药对SA9-7及ATCC25923抑菌（抑菌环直径=mm）

试验结果显示，清瘟败毒散提取液对临床分离的金黄色葡萄球菌SA9-7株具有良好的抑制作用。尽管该菌对常用抗菌药物有较强的耐药性，但对纯中药方剂清瘟败毒散的敏感性较高。同时，在组成中药方剂的单味中药中，黄连、金银花、连翘对SA9-7的抑制作用也比较明显；而丹皮、甘草在单独使用时对该菌没有明显效果。同时，试验方剂的抑菌作用显著好于单味中药。方剂及单味中药对SA9-7的抑制效果见图1。

对于药物最小抑菌浓度（MIC）的判断，按照CLSI标准M27-A3。结果显示，试验方剂清瘟败毒散提取液对SA9-7的MIC为0.016 g/mL，黄连单味药物对该菌的MIC为0.063 g/mL，其他金银花、连翘、丹皮和甘草依次为：0.063 g/mL、0.250 g/mL和0.125 g/mL。此外，试验中药方剂对ATCC25923的MIC为0.008 g/mL。

图1 方剂及单味中药对SA9-7的抑制效果

2.3 清瘟败毒散对S.aureus肠毒素生成的影响

从临床分离的金黄色葡萄球菌，约1/3可以产生肠毒素。肠毒素是一种可溶性蛋白质，耐热，经100℃煮沸30min不被破坏，也不受胰蛋白酶的影响[9]，是造成畜产品包括鸡肉等污染的主要因素，也是金黄色葡萄球菌的主要毒力评价因子之一[3]，其中SEA、SEB型通常被认为是S.aureus肠毒素的标志性类型。试验中，应用特异性抗体检测不同中药浓度下，临床分离株SA9-7肠毒素SEA、SEB的生成。结果如图2显示，在有S.aureus生长的情况下，中药清瘟败毒散提取液可以显著抑制SEA与SEB的生成，并且其作用强度与药物的浓度密切相关。

图2清瘟败毒散对S.aureus肠毒素的抑制作用

3 讨论

本试验表明，自肉鸡养殖场临床分离的S.au⁃reus菌株，对多种常用抗菌药物的敏感性不高，有不少的菌株对四环素、青霉素、氨苄青霉素、卡那霉素等药物表现出明显的耐药性。在当前情况下，很多养殖场肉鸡感染S.aureus后，普遍存在治疗困难，大剂量合并使用抗菌药物，是通常采用的主要方法之一，同时又是造成S.aureus耐药的原因之一。试验中，临床分离的菌株SA9-7，对本试验选择的8种药物均不敏感，并对其中4种药物表现为耐药，而这种广谱耐药菌株的出现，对该病的治疗构成了严重挑战。

相对于抗生素，中药方剂具有低药残留、无公害、不易耐药等优点，可作为肉鸡葡萄球菌病治疗的首要选择。很多研究表明，黄连、金银花、连翘等中药有良好的抗菌作用。本试验选用的中药方剂清瘟败毒散，根据中兽医理论，以黄连、金银花、连翘等抗菌中药为主药，配伍丹皮、黄芩、甘草等中药组成，并通过水浸水煎，制成中药提取液。试验结果显示，清瘟败毒散提取液对临床分离的金黄色葡萄球菌SA9-7株具有良好的抑制作用，对SA9-7的MIC为0.016 g/mL；同时，药物可以显著抑制S.aureus肠毒素SEA、SEB的生成。本试验探讨了中药治疗肉鸡葡萄球菌病的可能性，为防治禽葡萄球菌病提供了技术支持。

[1] 张艳英，关学敏，孙继国，等.肉仔鸡葡萄球菌病的诊治[J].中国家禽，2007，29（21）：48-49.

[2]马驰，林居纯，陈雅莉，等.禽源金黄色葡萄球菌耐药性监测[J].中国兽医杂志，2010，46（9）：10-12.

[3]Argudín MÁ，Mendoza M C，Rodicio M R.Food poisoning and Staphylococcus aureus enterotoxins[J].Toxins，2010，2（7）：1751-1773.

[4]Cao R，ZeakiN，Wallin-CarlquistN，etal.Elevated enterotoxin A expression and formation in Staphylococcus aureus and its associa⁃tion with prophage induction[J].Applied and environmentalmicro⁃biology，2012，78（14）：4942-4948.

[5]Pepe O，Blaiotta G，Bucci F，et al.Staphylococcus aureus and staphylococcal enterotoxin A in breaded chicken products：detec⁃tion and behavior during the cooking process[J].Applied and envi⁃ronmentalmicrobiology，2006，72（11）：7057-7062.

[6]Pinchuk IV，Beswick E J，Reyes V E.Staphylococcal enterotoxins[J].Toxins，2010，2（8）：2177-2197.

[7]PfallerMA，Boyken L，HollisR J，etal.Wild-typeMICdistributions and epidemiological cutoffvalues for the echinocandinsand Candida spp[J].Journal of clinicalmicrobiology，2010，48（1）：52-56.

[8]Ranque S，Lachaud L，Gari-ToussaintM，et al.Interlaboratory Re⁃producibility of Etest Amphotericin B and Caspofungin Yeast Sus⁃ceptibility Testing and Comparison with the CLSIMethod[J].Jour⁃nal of clinicalmicrobiology，2012，50（7）：2305-2309.

[9] Pereira V，Lopes C，Castro A，etal.Characterization for enterotox⁃in production，virulence factors，and antibiotic susceptibility of＜i＞Staphylococcus aureus isolates from various foods in Portugal[J].Food Microbiology，2009，26（3）：278-282.