菜薹与萝卜附加系回交后代外源萝卜染色体的FISH检测

（北京市农林科学院蔬菜研究中心，北京 100097）

菜薹与萝卜附加系回交后代外源萝卜染色体的FISH检测

赵 泓 马运其 丁云花*

（北京市农林科学院蔬菜研究中心，北京 100097）

采用荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH），以萝卜基因组特异序列pURsN作探针，分别与19份菜薹与萝卜附加系回交后代BC4A3d进行杂交，检测回交后代中外源萝卜染色体的存在情况。结果显示：只有1份材料BC4A3d-45没有杂交信号，其他18份材料均得到1个杂交信号，表明除了BC4A3d-45没有附加外源萝卜染色体之外，其余18份材料均含有1条外源萝卜染色体；该结果与分子标记鉴定结果一致。

荧光原位杂交技术；萝卜附加系；染色体

荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）是20世纪80年代末在已有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，具有直观、灵敏度高、信号强、能同时显示多种不同颜色等优点，已被广泛应用于遗传学、分子生物学等领域，（Ragburn & Gill，1985；Laptian et al.，1989；Fukui et al.，1994；Jiang & Gill，1994；奇文清和李愁学，1996；杨国华 等，2002），成为外源染色体（质）、外源染色体片段或基因鉴定的重要工具。在芸薹属作物上，FISH技术已被用于鉴别3个二倍体基本种和3个复合种一些染色体的标记（Hasterok & Maluszynska，2000a，2000b，2000c；Hasterok et al.，2001）。

本试验在分子标记鉴定的基础上，采用萝卜基因组探针pURsN检测19份菜薹与萝卜染色体附加系回交后代BC4A3d中的外源萝卜d染色体的存在情况，并验证这19份材料的分子标记鉴定结果。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2013年3～6月在北京市农林科学院蔬菜研究中心进行。在对菜薹与萝卜d染色体附加系回交后代BC4A3d进行分子标记鉴定的基础上，选取19株形态学性状与回交亲本菜薹非常接近的单株进行荧光原位杂交检测，其中18株含有萝卜d染色体特异分子标记，1株不含萝卜d染色体特异分子标记（图1）。每份材料取3～4个花序，将长度为1～3 mm的花蕾取下后立刻浸泡在新鲜的卡诺固定液中，4 ℃固定24 h后转入75%酒精保存。

图1 菜薹与萝卜附加系回交后代BC4A3d PCR检测结果

1～19分别代表BC4A3d-7、BC4A3d-9、BC4A3d-10、BC4A3d-12、BC4A3d-11、BC4A3d-16、BC4A3d-21、BC4A3d-23、BC4A3d-24、BC4A3d-36、BC4A3d-39、BC4A3d-41、BC4A3d-42、BC4A3d-48、BC4A3d-45、BC4A3d-59、BC4A3d-63、BC4A3d-65，下图同。

1.2 试验方法

1.2.1 萝卜探针制备 萝卜基因组特异探针pURsN的制备方法参见Hirai等（1995）的方法。

1.2.2 材料酶解 取固定后的花蕾于蒸馏水中浸泡10 min，用解剖针剥取花药，在柠檬酸缓冲液中浸泡5～10 min。用移液枪吸净缓冲液，每个花药加100 μL含有2%纤维素酶和0.5%果胶酶的混合酶液，放入37 ℃分子杂交炉中酶解3 h，再将花药转入蒸馏水中浸泡10 min。

1.2.3 制片 将酶解后的花药置于载玻片上，加20 μL新鲜的卡诺固定液，用镊子将花药轻轻敲碎，再加20 μL固定液将细胞打散。用酒精灯火焰灼烧固定。载玻片室温风干、过夜待用。

1.2.4 荧光原位杂交 参考Schrader等（2000）的方法进行荧光原位杂交，采用Nikon Eclipse 80i显微镜，在10倍目镜、20倍物镜下对杂交结果进行整体观察和初步判断；之后选取100倍物镜下的5～10个视野，采用NIS-Elements软件分别对2个光通道进行拍摄、叠加，然后进行信号分析和统计。

2 结果与分析

在荧光显微镜下进行观察，染色质为蓝色，信号为红色。在10倍目镜、20倍物镜下对杂交情况进行初判，之后在100倍物镜下随机选取5～10个视野进行拍摄，并将2个光通道叠加，结果如图2所示。其中18份材料均得到1个杂交信号，只有1份材料BC4A3d-45没有信号。该结果与分子标记鉴定结果一致。

图2 菜薹与萝卜附加系回交后代BC4A3d FISH检测结果

3 结论与讨论

本试验选择花蕾作试材的原因有两个：一是回交世代是一个分离世代，个体间可能存在差异，有的携带萝卜d染色体，有的则不携带。如果用种子萌发后的根尖作试材，有可能会丢失宝贵材料。二是每株回交后代具有众多的花蕾，试验材料数量不受限制。用花蕾作试材不仅可以知道回交后代含有萝卜染色体的数目，而且还可以观察减数分裂过程中萝卜染色体在整个细胞周期中的行为，为遗传育种试验方案设计提供参考。

在荧光显微镜观察过程中，发现个别材料大部分细胞具有1个信号，少部分细胞偶尔出现2个信号，或者没有信号；有的细胞会出现多个弱信号，或者1个强信号与多个弱信号混杂在一起。信号数目多可能是由于探针纯度不够或背景不干净造成的假信号；或者是2个细胞部分重叠，而信号都在没有发生重叠的部位。没有信号或信号很弱可能是由于细胞质较厚，或者杂交过程有瑕疵造成的。基于荧光原位杂交技术本身的特点，在兼顾试验结果准确可靠和尽可能提高工作效率的前提下，随机选取5～10个视野对细胞及其信号数目作统计。如果85%以上的细胞具有相同的信号数目，就认为这份材料具有信号数目的萝卜染色体数；否则需要对这份材料重新进行荧光原位杂交。小孢子母细胞是以单细胞形式分散固定在载玻片上，它的体积显著大于体细胞，10倍目镜、100倍物镜下一个视野中只能显示1个或1个半细胞。体细胞体积小，一个视野中会有许多细胞，细胞之间难免会相互重叠。为了保证细胞类型统一，同时信号分明，因此选择处于减数分裂间期的小孢子母细胞进行观察。

本试验选取的19份材料是在分子标记鉴定基础上筛选出来的，PCR扩增结果只有BC4A3d-45没有出现萝卜染色体的特异条带，而FISH鉴定结果也显示BC4A3d-45没有杂交信号，说明荧光原位杂交鉴定结果与分子标记鉴定结果一致。本试验采用荧光原位杂交技术不仅可以检测外源染色体的有无，还可以根据杂交信号的多少鉴定外源染色体的数目，这是分子标记技术不可替代的。本试验中18份材料都只有1个杂交信号，说明附加的萝卜d染色体是以单倍的形式存在。这种形式遗传不稳定，在每次回交过程中都会出现分离。因此，本试验材料需进一步进行自交，使附加的外源萝卜d染色体在后代中以二倍形式存在，才能得到可稳定遗传的附加萝卜d染色体的菜薹材料。

奇文清，李愁学．1996．植物染色体原位杂交技术的发展及应用．武汉植物学研究，14（3）：269-278．

杨国华，英加，李滨，刘建中，李振声．2002．荧光原位杂交技术在植物细胞遗传学和绘制基因图谱中的应用现状与展望．西北植物学报，22（2）：421-429．

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Hasterok R，Maluszynska J．2000a．Cytogenetic markers of Brassica napus chromosomes．Jappl Genet，41：1-9．

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Hasterok R，Maluszynska J．2000c．Nucleolar dominance does not occur in root tip cells of allotetraploid Brassica species．Genome，43：574-579．

Hasterok R，Jerkins G，Langdon T，Jones R N，Maluszynska J．2001．Ribosomal DNA is an effective marker of Brassica chromosomes．Theor Appl Genet，103：486-490．

Hirai K，Irifune K，Tanaka R，Morikawa H．1995．Molecular and cytological characterization of a highly repeated DNA sequence in Raphanus sativus．Genome，38：1237-1243．

Jiang J M，Gill B S．1994．Nonisotopic in situ hybridization and plant genome mapping the first 10 years．Genome，37：717-725．

Laptian N L V，Ganal M W，Tanksley S D．1989．Somatic chromosome karyotype of tomato based on in situ hybridization of TGRI satellite repeat．Genome，32：992-998．

Ragburn A L，Gill B S．1985．Use of biotin-labeled probes to map specific DNA sequences on wheat chromosomes．J Hered，76：78-81．

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Identification of Alien Radish Chromosome in Backcross Progeny of Tai-tsai and Radish Addition Line by FISH Technology

ZHAO Hong，MA Yun-qi，DING Yun-hua*

（Beijing Vegetable Research Center，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100097，China）

Nineteen plants from the backcross progeny BC4A3d derived from backcrossing radish additional line with tai-tsai were analyzed by using fluorescence in situ hybridization（FISH）technology with radish genomic probe pURsN to detect the exogenous radish chromosome in the backcross individuals，so as to confirm the added radish chromosome in the backcross progenies．The results showed that except BC4A3d-45 had no additional exogenous radish chromosome，other 18 plants of the backcross progeny were added an alien radish chromosome．This result is consistent with that of the previous molecular marker identification．

Fluorescent in situ hybridization；Radish addition line；Chromosome

赵泓，女，副研究员，专业方向：植物生物技术，E-mail：zhaohong@ nercv.org

*通讯作者（Corresponding author）：丁云花，女，副研究员，专业方向：蔬菜遗传育种，E-mail：dingyunhua@nercv.org

2014-01-08；接受日期：2014-03-12

国家自然科学基金项目（31071793）