乙烯、1-MCP对毛竹春笋老化和ERS1基因表达的影响

陈惠云，孙志栋，吴峰华，杨虎清

（1.浙江省宁波市农业科学研究院农产品加工研究所,浙江宁波 315040；2.浙江农林大学农业与食品科学学院,浙江临安 311300）

乙烯、1-MCP对毛竹春笋老化和ERS1基因表达的影响

陈惠云1，孙志栋1，吴峰华2，杨虎清2

（1.浙江省宁波市农业科学研究院农产品加工研究所,浙江宁波 315040；2.浙江农林大学农业与食品科学学院,浙江临安 311300）

毛竹春笋采收后在20℃条件下用外源乙烯和1-MCP处理,研究乙烯和1-MCP对采后毛竹春笋木质化的调控作用。结果表明,乙烯处理提高了木质素合成相关的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂醇脱氢酶（CAD）和过氧化物酶（POD）的活性和ERS1基因的表达,促进组织中木质素和纤维素的积累,加快了毛竹春笋采后老化；1-MCP处理显著降低了PAL、CAD和POD活性以及ERS1基因的表达水平,抑制了木质素和纤维素的积累,延缓了毛竹春笋采后木质化。推测毛竹春笋ERS1对乙烯信号是一种正调控模式,乙烯通过调控ERS1基因表达而影响毛竹春笋组织老化进程。

毛竹春笋；乙烯受体基因；cDNA克隆；乙烯；1-MCP；木质化

1 材料与方法

1.1 材料与处理

毛竹（Phyllostachys pubescens Mazel）春笋采自浙江省余姚市冯村,采收当天选取笋长在35 cm,基径在8 cm左右的春笋,随机分成3组,每组60支。将毛竹春笋洗净去壳,切除底部老蔸,用0.04%的NaClO溶液浸泡3 min,在通风处晾干。然后放入箱内放置有100 m L 1 mol的NaOH溶液200 L的密闭容器中,用不同药剂进行处理。

试验设3个处理：处理1空白对照（CK）,不用药剂；处理2用1μL·L-11-MCP；处理3用500μL·L-1乙烯。处理温度为20℃,处理时间均为8 h,重复3次。处理后置于恒温20℃,相对湿度80%～85%,自然光的室内,任其自然老化。每隔24 h从基部向顶端15 cm处取样。样品用液氮冷冻,保存于-80℃的超低温冰箱中,用于随后的RNA提取和生理指标测定。

1.2 测定项目及方法

1.2.1 乙烯释放量

取3个毛竹春笋在20℃、5 L容器内密闭1 h,抽取1 m L气样用SP6800A气相色谱仪（山东鲁南瑞虹化工仪器有限公司）测定乙烯含量,重复3次。气谱条件：氢焰离子化检测器, GDX502填充柱,载气、燃气、助燃气分别为N2、H2和空气,柱温100℃,检测温度100℃,进样温度120℃。

1.2.2 竹笋硬度

用TA-XT2 i型质构仪测毛竹春笋中部硬度,探头直径为5 mm,测试深度为6 mm,贯入速度为1 mm·s-1,取最大值,重复10次取平均值。

P21对HoxB4的调控机制及其影响造血干细胞增殖初步研究 … ……………… 李雪华，等(6):636

1.2.3 木质素和粗纤维含量

木质素和粗纤维含量测定分别参考鞠志国等［5-6］的方法并加以改进。

1.2.4 苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂醇脱氢酶（CAD）、过氧化物酶（POD）活性测定

称取5.0 g竹笋样品置于研钵中,加入10 m L 0.05 mol·L-1pH值7.8的磷酸缓冲液（含4% PVP,2 mmol·L-1EDTA和5 mmol·L-1巯基乙醇）,冰浴条件下研磨,将匀浆转移至离心管中,于4℃、12 000 r·min-1离心20 min,收集上清液,即为酶液。PAL参照Zucker［7］的方法测定, CAD参照Mansell等［8］的方法测定,POD参考Kochba等［9］的方法测定。

1.3 ERS l基因表达

毛竹春笋总RNA提取采用TRIzol Kit及其说明书提供的方法。根据克隆的毛竹春笋乙烯受体基因ERS1和ACTIN序列,利用Primer 5.0设计PCR引物（ERS1：5′-GATGCTTACCCATGAAATCAGAAGCAC-3′和5′-CTGACAAACCTCTTGCAAATGGCAAG-3′；ACTIN：5′-GACAATGGCACTGGAATGGTCA-3′和5′-GCTCCTGCTCATAATCAAGGGC-3）,委托上海Sangon生物技术公司合成。RNA的反转录参照Fermentas公司的M2MLV反转录酶产品说明书进行。PCR反应根据Taq DNA聚合酶产品说明书进行。扩增程序为：95℃4 min；94℃45 s,54℃30 s,72℃1 min；72℃10 m in。35个循环。PCR产物用1.2%琼脂糖/TAE电泳检测。电泳条带用Band leader 3.0图像软件分析,以目的基因与内参基因的电泳带平均光密度的比值作为基因表达的相对数值,重复3次。

2 结果与分析

2.1 乙烯释放量和硬度变化

如图1中A所示,常温下对照处理毛竹春笋的乙烯释放量缓慢上升,采后2 d达到最大,然后逐渐下降；乙烯处理促进了毛竹春笋的乙烯释放量,始终显著高于对照和1-MCP处理的毛竹春笋；1-MCP处理抑制了毛竹春笋乙烯生成,在采后3 d内,其乙烯释放量显著低于对照和乙烯处理的毛竹春笋。图1中B显示,采后毛竹春笋的组织硬度均呈上升趋势,乙烯处理毛竹春笋硬度快速上升且显著高于对照,而1-MCP处理抑制了毛竹春笋硬度的增加。

2.2 纤维素和木质素含量

图1 各处理春笋的乙烯释放量和硬度变化

图2 各处理春笋的木质素和纤维素含量变化

图2 显示,毛竹春笋采后20℃下的老化过程中,毛竹春笋木质素和纤维素含量均呈增加趋势,乙烯和1-MCP处理毛竹春笋的变化趋势与对照相似,但1-MCP处理显著抑制了木质素和纤维素的合成,4 d后木质素和纤维素比对照减少12.1%和8.2%,而乙烯处理则促进了毛竹春笋木质素和纤维素的积累,分别比对照高8.3%和9.2%。

2.3 PAL、CAD和POD活性

毛竹春笋采后在20℃环境中组织的PAL活性呈现峰型变化,贮藏前期PAL活性迅速上升,于采后3 d达到高峰,之后趋于下降（图3中A）；而CAD和POD活性是持续上升的,但后2 d上升趋于缓慢（图3中B和C）。乙烯处理提高了PAL、CAD和POD活性,始终高于对照水平,而1-MCP处理均有效地抑制APL、CAD和POD的活性。

2.4 ERS l基因的表达

如图4所示,毛竹春笋经外源乙烯处理后,与对照相比,能够显著促进组织中ERS1基因的表达,加速毛竹春笋木质化,而1-MCP处理则明显抑制ERS1基因的表达,从而延缓了毛竹春笋组织的老化。

图3 各处理春笋的PAL、CAD和POD活性变化

图4 各处理春笋的ERS1表达变化

3 小结与讨论

竹笋采后易木质化。植物木质化作用是木质素单体经聚合反应形成木质素大分子沉积在细胞壁的过程,组织木质化是细胞次生壁形成的主要特征之一,木质素单体合成则是木质化作用的中心［10］。提高PAL、CAD或POD酶活性可显著增加植物组织木质素含量［11］。通过反义RNA技术抑制这些酶的活性,均能够改变木质素的含量和构成［12］。本试验中,采用乙烯处理促进毛竹春笋的乙烯释放,提高了PAL、CAD和POD活性,显著增加了毛竹春笋组织中木质素和纤维素的积累,加速了毛竹春笋老化。而1-MCP处理则降低了采后毛竹春笋的乙烯释放速率,抑制了PAL、CAD和POD活性以及木质素和纤维素的合成,延缓了老化,这和罗自生等［3］的研究结果一致。

乙烯调控毛竹春笋老化与受体基因表达有关。在乙烯信号传导过程中,植物激素乙烯只有与受体结合,通过一系列的信号传导,才能诱导植物衰老反应［13］。在拟南芥中乙烯的感受包括5个与膜结合的乙烯受体基因（ETR1、ERS1、ETR2、ERS2和EIN4）,并且乙烯受体是乙烯反应的负调控因子［14］。从番茄果实中已分离出6个乙烯受体基因［15］。本试验克隆了毛竹春笋乙烯受体基因ERS1,并分析了ERS1对乙烯和1-MCP处理的相应表达水平,发现ERS1对乙烯信号表达上调,对1-MCP表达下降,因此,推测毛竹春笋ERS1对乙烯信号是一种正调控模式,贺立红等［16］也报道香蕉ERS1对乙烯是正调控。乙烯和1-MCP通过调控ERS1基因表达而影响毛竹春笋组织老化进程。

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（责任编辑：张才德）

S 644.2

A

0528-9017（2014）03-0336-03

文献著录格式：陈惠云,孙志栋,吴峰华,等.乙烯、1-MCP对毛竹春笋老化和ERS1基因表达的影响［J］.浙江农业科学,2014（3）：336-338,343.

2013-12-19

宁波市自然科学基金项目（2012A610134）；宁波市农业重大（重点）择优委托科技攻关项目（2012C10018）

陈惠云（1980-）,女,浙江余姚人,农艺师,主要从事农产品贮藏与加工研究工作。E-mail：chhyun@163.com。

杨虎清。E-mail：yanghuqing@sohu.com。