扎考必利后处理对离体大鼠心脏的保护作用

廖志辉，龙 村，冯正义

·基础研究·

扎考必利后处理对离体大鼠心脏的保护作用

廖志辉，龙 村，冯正义

目的 观察内向整流钾离子（IK1）通道激活剂扎考必利在缺血后处理中的作用并探讨可能存在的有关机制。方法 24只大鼠离体心脏，随机分为非缺血组，缺血再灌组和扎考必利后处理组，分别进行灌注Krebs–Henseleit（K－H）液60 min；缺血30 min再灌注K－H液30 min；缺血30 min再灌注含1 μmol／L扎考必利的K－H液5 min后改用不含扎考必利的KH液灌注25 min。记录心率（HR），左室发展压（LVDP），左室内压的最大上升下降速率（±dp／dtmax）等血流动力学数据，冠脉流速（CF）和心律失常情况。再灌注结束后测量冠脉流出液中的肌钙蛋白I（cTnI），丙二醛（MDA），总超氧化物歧化酶（TSOD）含量，并用2，3，5—氯化三苯基四氮唑（TTC）染色测心梗面积。结果 与缺血再灌注组相比，扎考必利后处理组可增加缺血再灌注30 min时的HR，LVDP，＋dp／dtmax，CF，减少心律失常的发生并减少cTnI及MDA的生成，增加SOD的活性，减少心梗面积。结论 扎考必利后处理可以有效减轻再灌注后心肌损伤，保护心脏收缩功能和减少心律失常的发生。

缺血后处理；内向整流钾离子通道；扎考必利；心律失常

心脏手术后的心功能下降和心律失常与缺血再灌注（ischemic reperfusion，IR）损伤密切相关。缺血后处理能减轻心肌IR损伤，有助于维持心脏正常的结构，功能和电活动［1－2］。扎考必利是选择性的内向整流钾离子（IK1）通道受体激动剂，许多研究表明其在抗心律失常和心肌保护方面具有重要的意义［3－4］。本实验旨在观察利用扎考必利（Zacopride）进行缺血后处理对心脏保护的效果。

1 材料与方法

本实验设计实施符合动物伦理的相关规定并通过阜外医院伦理委员会审批。

1.1 动物 雄性Sprague－Dawley（SD）大鼠24只，体重250～300 g，由阜外医院动物中心提供。

1.2 药物及相关溶液 Krebs－Henseleit（K－H）液由阜外医院病理中心配制，其成分为（mmol／L）：葡萄糖 11.0，NaCl 118.5，KCl4.75，MgSO41.19，KH2PO41.18，NaHCO325.0，CaCl21.4；扎考必利（Zacopride，Cat.No.1795，Tocris Bioscience，Bristol，UK）；2，3，5－氯三苯四唑（2，3，5－Triphenyltetrazoli⁃um chloride，TTC，Sigma）。

1.3 主要设备 Langendorff恒压灌注装置；血流动力学及心电监测设备（AD Instruments）；纯水机（Millipore Milli－Q Biocel France）；pH测定仪（Orion 818）；恒温水浴箱（北京东方仪器厂）。

1.4 实验方法

1.4.1 Langedorff离体心脏模型的建立 50 mg／kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，1 000 U／kg肝素经股静脉注射抗凝。迅速取出大鼠心脏，置于4℃K－H液中轻轻挤压数次，去除心腔内残余血液，从主动脉断端置入Langendorff灌注针头深度2～3 mm，通过4＃外科缝线固定主动脉根部于灌注针头。灌注时，灌注液均采用恒温水浴箱加热到37℃，并用95%O2－5% CO2饱和10 min以上，并始终保持灌注液面至心尖的高度为100 cm，以维持100 cm H2O恒压灌注。

1.4.2 实验分组 24只大鼠（n＝8）心脏经K－H液灌注20 min平衡后随机分为非缺血组（NI组）：KH液持续灌注60 min；缺血再灌注组（I／R组）：持续全心缺血30 min后，用K－H液再灌注30 min；扎考必利后处理组（ZP组）：持续缺血30 min后，再灌注含1 μmol／L扎考必利的K－H液5 min之后改用不含扎考必利的K－H液灌注25 min。

1.5 观测指标

1.5.1 血流动力学 观测左室发展压（LVDP），左室内压的最大上升下降速率（±dp／dtmax），心率（HR）冠脉流速（CF）。左心耳开孔后，经二尖瓣置入测压球囊并固定，连接测压装置（AD Instruments）通过Chart IV软件进行数据采取。

1.5.2 心律失常 通过连接于心尖和心底的电极记录心电图，观察心律失常情况并进行评分。心律失常的判断按照 Lambeth会议标准，评分则参考Curtis等人的评分规则，当＜50个室性早搏（VPB）为0分，＞50个室性早搏为1分，1～5次室性心动过速（VT）为2分，＞6次室性心动过速为3分，自发终止的心室颤动（VF）≤40 s或一次顽固性的心室颤动＞40 s为4分，2～5次顽固性的心室颤动为5分，＞5次顽固性的心室颤动为6分［5］。

1.5.3 CF及冠脉流出液中肌钙蛋白I（cTnI），丙二醛（MDA），总超氧化物歧化酶（T－SOD） 在平衡期20 min，再灌注开始5 min，10 min，30 min等四个时点，用试管收集30 s的冠脉流出液用来测量容积并计算流速，将平衡期20 min和再灌注30 min的冠脉流出液各1 ml于－80℃冻存（保存期＜1个月）。采用cT⁃nI试剂盒（Troponin I ELISA.TPI Kit，Washington，USA），MDA和T－SOD试剂盒（南京建成）按照其说明对冻存标本进行cTnI浓度，MDA和T－SOD活性检测。

1.5.4 心肌梗死面积 每组（n＝5）灌注结束后，取下心脏置入－20℃冷冻箱中冻存30 min，垂直于心脏纵轴切成5片，置入37℃ 0.1 mol／L的TTC溶液中染色15 min后，拍摄切片正反面照片，灰白色部分为梗死区，红色部分为非梗死区。利用photoshop 11.0软件对梗死区进行测量，计算左室心肌梗死面积及其占左室总面积百分比。

1.6 统计分析 应用SPSS 16.0统计软件进行统计分析，三组血流动力学，冠脉流速和冠脉流出液中酶学指标的检测结果和心肌梗死面积百分比以均数±标准差（±s）表示；心律失常数据为偏态分布，故以中位数（四分位数间距）表示。以单因素方差分析两两对比组间同一时点差异（多组间数据比较采用方差分析（ANOVA），若总体差异显著，再以t检验分析相应两组间的显著性差别）。心律失常发生率采用卡方检验。P＜0.05有统计学意义。

2 结 果

2.1 血流动力学和CF 各组的HR，±dp／dtmax，LVDP以及CF的基础值之间无统计学差异。与NI组相比，再灌注的各时点，ZP组与I／R组的HR与NI组相比均显著降低（P＜0.05）；但ZP组的HR在各时点均高于I／R组。再灌注5 min时，与NI组相比I／R组的LVDP显著增加（P＜0.05），但在再灌注15 min和30 min后显著降低（P＜0.05）；而ZP组的LVDP在再灌注5 min时显著小于I／R组（P＜0.05），在再灌注15 min和30 min后显著大于I／R组（P＞0.05）。与NI组的±dp／dtmax相比，I／R组与ZP组在各时点均有不同程度下降；与I／R组相比，ZP组各时点的±dp／dtmax均较高，其中ZP组的＋dp／dtmax在15 min和30 min显著大于I／R组（P＜0.05）。与NI组的CF相比，I／R组与ZP组在各时点均减少；在再灌注30 min时，ZP组显著大于I／R组（P＜0.05）。见表1。

2.2 心脏冠脉流出液中酶学指标的检测结果 三组心肌漏出液的cTnI，MDA和SOD在平衡期无显著差异，在再灌注30 min时，ZP组的cTnI显著低于I／R组［（3.28±0.69）ng／L vs.（5.40±0.89）ng／L，P＜0.05］。ZP组的MDA小于I／R组，但无统计学差异（P＞0.05）。ZP组的T－SOD含量显著高于I／R组和NI组［（375.50±59.48）ng／L vs.（291.87±41.75）ng／L，（144.87±36.33）ng／L，P＜0.05］。见图1。

表1 三组心脏在不同时点的血流动力学与冠脉流量（n＝8，±s）

表1 三组心脏在不同时点的血流动力学与冠脉流量（n＝8，±s）

注：与同时点的NI组比较∗P＜0.05；同时点的I／R组比较＃P＜0.05。

观察指标 分组 基础值再灌注5 min 15 min 30 min HR（bpm） NI组 303±16 319±14 319±17 298±11 I／R组 309±19 93±10∗ 194±11∗ 204±15∗ZP组 299±11 106±14∗ 265±17∗＃ 265±17∗＃LVDP（mm Hg） NI组 122±9 124±14 115±10 114±9 I／R组 118±12 161±6∗ 97±8∗ 82±6∗ZP组 115±10 131±9＃ 112±9＃ 116±8＃＋dp／dtmax（mm Hg／s） NI组 5 056±415 5 078±178 5 006±210 4 950±247 I／R组 5 143±361 2 902±212∗ 3 112±96∗ 2 807±187∗ZP组 4 976±233 2 979±231∗ 3 687±172∗＃ 3 824±313∗＃－dp／dtmax（mmHg／s） NI组 －3 173±344 －2 950±304 －2 827±286 －2 632±357 I／R组 －3 046±188 －767±158∗ －1762±124∗ －1 927±454∗ZP组 －3 066±246 －990±88∗ －2 62±323∗＃ －2 190±205 CF（ml／min） NI组 11.9±0.7 11.4±1.6 10.1±0.8 8.9±0.6 I／R组 12.2±1.5 8.8±0.3∗ 8.1±0.2∗ 6.8±0.6∗ZP组 12.0±2.0 8.9±0.2∗ 8.5±0.2∗ 8.2±0.2∗＃

图1 三组冠脉流出液中cTnI、MDA和T－SOD变化

2.3 心律失常 与NI组相比，I／R组与ZP组的VPB持续时间和VT次数均显著增加。但与I／R组相比，ZP组的VPB持续时间，VT次数和心律失常评分显著减小（P＜0.05），VT和VF的发生率虽然小于I／R组，但无统计学差异（P＞0.05）。见表2。

2.4 心梗面积 I／R组与ZP组的心肌梗死面积均大于NI组，但I／R组增加更为显著（P＜0.05）。ZP组的心肌梗死面积小于I／R组，但无统计学差异［（19±3）%vs.（28±8）%，P＞0.05］。见图2。

3 讨 论

大量研究表明，心肌缺血后处理可以减轻心肌缺血再灌注的损伤。最近，Piao等的研究表明在缺氧发生时，IK1通道开放增加使心肌细胞的动作电位时间（action potential duration，APD）缩短［6］。而阻断IK1通道可以消除缺血预处理的心肌保护作用，增加缺血再灌注时的心肌细胞死亡率［7］。这些现象提示，IK1通道在心脏的缺血再灌注损伤中可能发挥着重要作用。

扎考必利属苯甲酰胺衍生物，是一种5－羟色胺4（5－HT4）受体激动剂，研究表明多种5－HT受体激动剂都对心肌电流存在不同程度影响，其中扎考必利主要是通过蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）等途径特异性的激活心肌细胞的IK1通道［8－9］。本研究假设通过扎考必利后处理，特异性激活IK1通道，可以通过缩短APD起到抗再灌注损伤和心律失常等作用［10］。

与Gong等人的实验所采取的缺血策略相似，本实验采用的缺血／再灌注时间为30 min缺血／30 min再灌注模型［11］。本实验的结果表明，利用扎考必利后处理可以增加再灌注时心率，这与Zaritsky等的研究所发现抑制IK1电流可以降低心率的结果相一致，其研究认为心率的增加可能与缩短动作电位时程及QT间期有关［12］。在本实验中通过血流动力学监测观察到，再灌注5 min时扎考必利后处理组的LVDP显著小于I／R组，但±dp／dtmax及HR均大于I／R组，这提示扎考必利后处理可以减少再灌注早期过度的心肌收缩，并使再灌注心脏保持较好的兴奋性。虽然并不知道其具体的原因，但猜测可能与缩短APD减少了再灌注早期的钙内流引起的钙超载和心肌的过度收缩有关［13］。扎考必利后处理组在再灌注期间的冠脉流速显著高于I／R组，其机制可能与IK1通道在冠脉血管内皮细胞的表达上调产生的扩张血管作用有关［14］。通过检测冠脉流出液中三种酶的含量发现，扎考必利后处理可以减少脂质过氧化物MDA的产生，增加SOD的活性。提示扎考必利后处理可能通过减少脂质过氧化而发挥保护作用。有研究表明激活IK1通道后，再灌注期间细胞内钾离子浓度减小，有助于细胞内的钠离子浓度升高导致钠钙交换减少，从而减少细胞内钙超载［15］。而钙超载是引起脂质过氧化的重要因素之一。据此，笔者推测IK1通道激活，可能与减少细胞内钙超载而产生的抗氧化作用有关。但与本实验结果不同的是，Campo等发现再灌注期间大鼠心脏的SOD较缺血前显著降低，这可能是其采取不同的缺血模型所引起的差异。他们的实验采用1 h的大鼠在体左冠状动脉结扎和6 h时的再灌注，且测量的SOD活性来源于心肌组织，因此，并不能排除血液、神经和体液等的影响［16］。而Shuvaev等实验表明缺血时间以及血液中的白细胞水平，对SOD水平均存在较大的影响［17］。本实验中采用离体心脏缺血模型，受神经体液及白细胞的影响较少，这可能是造成本实验的结果与Campo等在实验中所观察到的再灌注引起SOD低于基础值的实验结果不一致的原因之一。

表2 再灌注期间三组心脏的心律失常情况［n＝8；数据以中位数（四分位数间距）表示］

图2 三组灌注结束后的心梗面积

在心律失常方面，缺血再灌注所导致的心律失常与氧自由基增加，钙超载，外向钾电流减少所引起的APD延长所导致的早后除极以及跨壁复极离散度增加有关［18］，激活IK1通道可以显著缩短APD，减少早后除极的发生。本实验中，ZP组与I／R相比总体评分优于I／R组，ZP组的室性早搏和室性心动过速的持续时间显著小于I／R。说明扎考必利在缺血再灌注时具有显著的抗心律失常作用，这可能对再灌注早期维持正常的心输出量具有重要的意义。

另外，通过cAMP－PKA信号途径的促进核因子κB（NF－κB）的活化，减少炎性因子基因转录是一条重要的心肌保护途径［19］。而扎考必利主要是通过激活PKA产生的IK1通道开放作用。因此，扎考必利是否存在PKA依赖的抗炎作用？还需要进一步的研究。另外有研究表明心肌5－HT4受体介导了心肌的正性变力作用，但其表达在出生后逐渐退化，而心衰时被重新激活［20］，这与扎考必利的抗心律失常作用是否存在关系，需要更多的实验证实。ZP组的心肌梗死面积小于I／R组，但差异并不显著，这可能与本实验选取的观测终点的时程较短，缺血再灌注过程引起的很多变化可能还没有充分表现出来，各组心肌梗死的现象可能不够充分有关。

通过本实验证明，扎考必利后处理可显著减少缺血再灌注引起的心肌损伤。这种保护作用的机制，可能与IK1通道激活后，缩短APD，增加心率，减少恶性心律失常的发生和抗氧化作用有关。但具体的机制和途径还需要进一步的研究。

［1］ Zhao ZQ，Corvera JS，Halkos ME，et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion：comparison with ischemic preconditioning［J］.Am J Physiol Heart Circ Physi⁃ol，2003，285（2）：H579－588.

［2］ Ovize M，Baxter GF，DiLisa F，et al.Postconditioning and pro⁃tection from reperfusion injury：where do we stand？Position paper from the Working Group of Cellular Biology of the Heart of the Eu⁃ropean Society of Cardiology［J］.Cardiovasc Res，2010，87：406－423.

［3］ Liu QH，Li XL，Xu YW，et al.A novel discovery of IK1 channel agonist：zacopride selectively enhances IK1 current and suppresses triggered arrhythmias in the rat［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2012，59（1）：37－48.

［4］ Wu B，Long C，Hei F，et al.The protective effect of St.Thomas cardioplegia enriched with zacopride on the isolated rat heart［J］.Artificial Organs，2013，37（1）：E44－50.

［5］ Curtis MJ，Walker MJ.Quantification of arrhythmias using scoring systems：an examination of seven scores in an in vivo model of re⁃gional myocardial ischaemia［J］.Cardiovasc Res，1988，22（9）：656－665.

［6］ Piao L，Li J，McLerie M，et al.Cardiac IK1 underlies early ac⁃tion potential shortening during hypoxia in the mouse heart［J］.J Mol Cell Cardiol，2007，43（1）：27－38

［7］ Diaz RJ，Zobel C，Cho HC，et al.Selective inhibition of inward rectifier K＋channels（Kir2.1 or Kir2.2）abolishes protection by ischemic preconditioning in rabbit ventricular cardiomyocytes［J］.Circ Res，2004，95（3）：325－332.

［8］ Fakler B，Brandle U，Glowatzki E，et al.Kir2.1 inward rectifier K＋channels are regulated independently by protein kinases and ATP hydrolysis［J］.Neuron，1994，13（6）：1413－1420.

［9］ 刘清华，许言午，吴博威.Zacopride增强心肌内向整流钾电流（IK1）效应的受体和信号转导通路 ［J］.中国病理生理杂志，2012，28（1）.6－10.

［10］ Liu QH，Li XL，Xu YW，et al.A novel discovery of IK1 channel agonist：zacopride selectively enhances IK1 current and suppresses triggered arrhythmias in the rat［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2012，59（1）：37－48.

［11］ Gong JS，Yao YT，Fang NX，et al.Sevoflurane postconditioning attenuates reperfusion－induced ventricular arrhythmias in isolated rat hearts exposed to ischemia／reperfusion injury［J］.Mol Biol Rep，2012，39（6）：6417－6425.

［12］ Zaritsky JJ，Redell JB，Tempel BL，et al.The consequences of disrupting cardiac inwardly rectifying K（＋）current（I（K1））as revealed by the targeted deletion of the murine Kir2.1 and Kir2.2 genes［J］.J Physiol，2001，533（Pt 3）：697－710.

［13］ Pott C，Ren X，Tran DX，et al.Mechanism of shortened action potential duration in Na＋－Ca2＋exchanger knockout mice［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2007，292（2）：C968－973

［14］ Forsyth SE，Hoger A，Hoger JH.Molecular cloning and expression of a bovine endothelial inward rectifier potassium channel［J］.FEBS lett，1997，409（2）：277－282.

［15］ Weisser－Thomas J，Piacentino V 3rd，Gaughan JP，et al.Calci⁃um entry via Na／Ca exchange during the action potential directly contributes to contraction of failing human ventricular myocytes［J］.Cardiovasc Res，2003，57（4）：974－85.

［16］ Campo GM，Squadrito F，Campo S，et al.Beneficial effect of rax⁃ofelast，an hydrophilic vitamin E analogue，in the rat heart after ischemia and reperfusion injury［J］.J Mol Cell Cardiol，1998，30（8）：1493－503.

［17］ Shuvaev VV，Han J，Tliba S，et al.Anti－Inflammatory Effect of Targeted Delivery of SOD to Endothelium：Mechanism，Synergism with NO Donors and Protective Effects In Vitro and In Vivo［J］.PloS one，2013，8（10）：e77002.

［18］ Mugelli A，Cerbai E，Barbieri M，et al.Cellular electrophysiolog⁃ical aspects of myocardial protection［J］.Pharmacol Res，1995，31（3－4）：243－249.

［19］ Yang C，Talukder MA，Varadharaj S，et al.Early ischaemic pre⁃conditioning requires Akt－and PKA－mediated activation of eNOS via serine1176 phosphorylation［J］.Cardiovasc Res，2013，97（1）：33－43.

［20］ Brattelid T，Qvigstad E，Moltzau LR，et al.The cardiac ventricu⁃lar 5－HT4 receptor is functional in late foetal development and is reactivated in heart failure［J］.PloS One，2012，7（9）：e45489.

The protection of Zacopride postconditioning against the reperfusion injury in rat hearts

Liao Zhi－hui，Long Cun，Feng Zheng－yi
Department of Cardiopulmonary bypass of Cardiovascular Institute and FuWai Hospital，Beijing 100037，China Corresponding author：Feng Zheng－yi，Email：fwzyfeng＠gmail.com

Objective To observe the effect of zacopride，an inward rectifier potassium（IK1）channel agonist，in the post⁃conditioning against myocardial ischemia reperfusion injury and to explore its mechanisms.Methods 24 isolated lagendorff rat hearts were randomly divided into non－ischemia group（NI group，n＝8），ischemia／reperfusion group（IR group，n＝8）and zacopride post⁃conditioning group（ZP group，n＝8）.Krebs－Henseleit（K－H）buffer was perfused for 60 min in NI group.In IR group，after a peri⁃od of 30 min ischemia，K－H buffer was perfused for 30 min.While in the ZP group，after a period of 30 min ischemia，K－H buffer containing 1 μmol／L zacopride was persued for 5 min，and then a period of 25 min normal K－H buffer perfusion was followed.Hemo⁃dynamic data of three groups including the heart rate（HR），left ventricular developed pressure（LVDP），maximum positive and nega⁃tive derivative of left ventricular pressure（±dp／dtmax）and coronary flow（CF）were recorded.Coronary effluent was collected to measure the concentration of cardiac troponin I（cTnI），malondialdehyde（MDA）and total superoxide dismutase（T－SOD）.Myocar⁃dial infarction size was measured by 2，3，5－triphenyl tetrazolium chloride（TTC）staining.Results Compared with that in the IR group，cardiac hemodynamic data of LVDP，＋dp／dtmaxand CF in the ZP group was improved significantly.Compared whith that in the other two goups，the incidence of arrhythmia，the generation of cTnI and MDA，and myocardial infarction size reduced significantly，and the SOD activity enhanced apparently in the ZP group.Conclusion Zacopride postconditioning can effectively reduce myocardial injury of ischemia reperfusion by increasing cardiac function and reducing the incidence of arrhythmia.

Ischemia postconditioning；Inward rectifier potassium channel；Zacopride；Arrhythmia

2013⁃12⁃28）

2014⁃02⁃12）

10.13498／j.cnki.chin.j.ecc.2014.02.16

100037北京，中国医学科学院阜外心血管病医院体外循环中心

冯正义，Email，fwzyfeng＠gmail.com