利多卡因对肺缺血再灌注损伤模型大鼠炎症反应因子的影响

倪程耀，陈 新，吴胜军（浙江大学医学院附属第一医院，杭州 310003）

肺缺血再灌注损伤（Lung ischemia reperfusion injury，LIRI）常发生在体外循环手术、肺移植、肺栓塞治疗恢复血液供应后，是在缺血的基础上机体继发的再灌注损伤，会导致患者临床症状不减轻反而加重的病理状态，是危害患者恢复健康的重要障碍[1]。随着人们对LIRI发病机制的深入研究，已应用多种药物治疗LIRI，并取得了良好的效果。利多卡因作为一种膜稳定剂，广泛地应用于多种疾病的治疗，现研究认为其能保护肺泡上皮细胞的功能，可减轻肺损伤[2]。因此本研究应用大鼠建立LIRI模型，体外给予利多卡因干预，观察其对LIRI的保护作用。

1 材料

1.1 仪器

DH-150型动物呼吸机（浙江大学医学仪器厂）。

1.2 药品与试剂

利多卡因注射液（江苏济川制药有限公司，批号：080531，规格：40 mg ∶5 ml）；苯巴比妥钠注射液（广东邦民制药有限公司，批号：041042，规格：100 mg ∶1 ml）；肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1、IL-6和IL-8检测试剂盒（美国eBioscience公司）。

1.3 动物

2 方法

2.1 建模

大鼠经耳缘静脉注射30 mg/kg的苯巴比妥钠麻醉，气管切开后插管，接动物呼吸机控制呼吸，呼吸频率60次/min，潮气量单侧肺通气8～10 ml/kg，双侧肺通气15～20 ml/kg，呼吸比1 ∶2。然后经胸骨右缘第3～5肋间开胸，离断周围组织，游离左肺门，呼气末时结扎右肺门，60 min后开放行再灌注，制成LIRI模型。

2.2 分组与给药

取90只大鼠随机均分为假手术组、模型组和预处理组，每组30只。模型组大鼠行左肺缺血再灌注，即开胸游离左肺门后，阻断左肺门60 min，而后松开血管夹形成再灌注；假手术组大鼠只开胸而不行左肺缺血再灌注；预处理组大鼠术前15 min注射利多卡因1.2 mg/kg，并以1 mg/（kg·h）维持30 min，阻断左肺门60 min，而后松开血管夹形成再灌注。

2.3 标本采集与指标检测

各组大鼠于缺血30 min和再灌注60、120 min时采集标本。采集大鼠支气管肺泡灌洗液，采用考马斯亮蓝染色法对其蛋白总量（TP）进行测定；收集支气管肺泡灌洗液沉渣，计数白细胞（WBC）数量，并采用瑞氏染色进行白细胞分类，计算中性粒细胞（PMN）比例；取一定的肺组织，应用天平称量其湿质量（W），置于70 ℃烤箱烘烤48 h后，测量其干质量（D），计算肺组织的湿/干质量（W/D）比值；取肺组织配制成10%的组织匀浆，采用酶联免疫吸附双抗体夹心法（ELISA）检测肺组织匀浆中TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8含量，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 TP、WBC数量、PMN比例、W/D比值结果

与假手术组比较，模型组大鼠再灌注60、120 min时和预处理组再灌注120 min时TP、WBC数量、PMN比例、W/D比值均明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，预处理组大鼠再灌注60、120 min时TP、WBC数量、PMN比例、W/D比值均明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。各组大鼠肺泡灌洗液中TP、WBC数量、PMN比例和W/D比值比较见表1。

表1 各组大鼠肺泡灌洗液中TP、WBC数量、PMN比例和W/D比值比较（，n＝10）Tab 1 Comparison of TP，WBC，PMN proportion andW/D in bronchoalveolar lavage fluid in each group rats（，n＝10）

表1 各组大鼠肺泡灌洗液中TP、WBC数量、PMN比例和W/D比值比较（，n＝10）Tab 1 Comparison of TP，WBC，PMN proportion andW/D in bronchoalveolar lavage fluid in each group rats（，n＝10）

与假手术组比较：＊P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05vs.sham operation group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

3.2 TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8含量结果

与假手术组比较，模型组大鼠再灌注60、120 min时和预处理组再灌注120 min时肺组织匀浆中TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8含量均明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，预处理组大鼠再灌注60、120 min时肺组织匀浆中TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8含量均明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。各组大鼠肺组织匀浆中TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8含量比较见表2。

表2 各组大鼠肺组织匀浆中TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8含量比较（，pg/ml，n＝10）Tab 2 Comparison of the contents of TNF-α，IL-1，IL-6 and IL-8 in lung tissue homogenate in each group rats（，pg/ml，n＝10）

表2 各组大鼠肺组织匀浆中TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8含量比较（，pg/ml，n＝10）Tab 2 Comparison of the contents of TNF-α，IL-1，IL-6 and IL-8 in lung tissue homogenate in each group rats（，pg/ml，n＝10）

与假手术组比较：＊P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05vs.sham operation group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

4 讨论

近年来，由于LIRI的存在使应用心肺置换术、心肺转流术等的心肺疾病晚期患者临床症状加重，成为术后恢复健康的重要障碍。有报道称，肺移植术后因LIRI导致的死亡率高达16%～25%，严重影响了患者的生命健康，是临床亟需解决的问题[3]。有关LIRI的发病机制至今不明，但多数研究认为其与以下因素有关：氧自由基的释放、脂质过氧化反应、钙稳态的失衡、炎性物质的浸润、免疫因素的干扰及细胞凋亡[4]。其中，免疫因素的干扰占有举足轻重的地位。

免疫因素可通过以下途径参与到LIRI的发病机制中：（1）炎性细胞因子与相应受体结合，激活溶酶体使其溶解消化肺组织；（2）刺激血管内皮细胞分泌黏附分子，增加WBC的黏附作用及聚集作用；（3）刺激巨噬细胞分泌趋化性因子，加重炎症反应，可使PMN大量聚集，导致细胞坏死，释放过氧化物和溶酶体酶等，加剧免疫反应，从而导致肺组织损伤[5-7]。已有研究表明，在LIRI后的肺泡灌洗液中，TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8含量显著高于血浆中水平，提示了免疫反应在LIRI方面的重要性[8]。从本研究可以看出，模型组大鼠W/D比值及肺泡灌洗液中WBC数量、PMN比例及TP明显高于假手术组（P＜0.05），说明在再灌注中确实存在肺组织损伤及WBC与PMN的聚集。随着再灌注时间的推移，损伤及聚集作用随疾病进展逐渐加剧。模型组大鼠中再灌注60、120 min时肺组织匀浆中TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8含量明显高于假手术组（P＜0.05），验证了炎性细胞因子参与了LIRI的发病机制，并且肺组织匀浆炎性因子含量随疾病的进程相应增加，说明炎性因子随疾病进展存在着相对应的变化。这一研究结果与国内相关研究[9-10]基本吻合，均提示免疫因素在LIRI疾病中起着重要作用。

随着人们对LIRI发病机制研究的逐步深入，可应用多种内、外源性的化学物质对LIRI进行治疗，从而达到保护肺的作用。其治疗药物根据不同的机制可分为以下几类：（1）抗氧化剂或抗氧化酶，如胆红素、黄酮类、氨溴索；（2）抑制细胞核因子κB（NF-κB）信号通路因子，如抗炎性因子、山莨菪碱、前列腺素E1等；（3）通过信号分子途径，如吸入一氧化氮及一氧化碳、乌司他丁、黄酮化合物等；（4）炎症因子和细胞黏附因子，如盐酸氨溴索、糖皮质激素、分泌型白细胞蛋白酶抑制剂、罗格列酮等[11]。其中，利多卡因被认为是膜稳定剂，可抑制中性粒细胞的炎性反应，通过多种途径来减轻LIRI并加大肺损伤的修复，其机制可归纳为以下几点：（1）稳定细胞膜，抑制炎性反应的各个环节；（2）促进肺泡上皮细胞生长，抑制肺泡上皮细胞凋亡[12]。从本研究结果可以看出，应用利多卡因一段时间后，大鼠W/D比值及肺泡灌洗液中WBC数量、PMN比例及TP明显低于模型组（P＜0.05），肺组织匀浆TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8含量也明显低于模型组（P＜0.05），提示利多卡因可通过抑制炎症反应来减缓LIRI，从而改善肺组织损伤，符合国内外对利多卡因作用机制的研究。

综上所述，本实验建立在针对大鼠的LIRI模型上，在不同时间点上动态观察了免疫相关指标在疾病进程中的变化，并体外给予利多卡因，观察了免疫相关指标的变化。LIRI的主要病理改变为肺组织内皮的广泛破坏、肺毛细血管通透性的增加，从而导致肺泡和间质的水肿和损伤。其机制复杂，早期给予干预措施，可大大提高治愈率和预后恢复。本研究结果显示，免疫因素尤其是炎性细胞因子在LIRI的疾病进展中发挥了重要作用，利多卡因可通过抑制炎性反应来改善肺组织的损伤。本实验从炎性反应因子这一角度探讨了利多卡因改善LIRI的机制，为临床应用该药提供了理论依据，但其临床具体应用仍需进一步研究。

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