知母皂苷AⅢ对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响Δ

潘会君，莫小辉，冯彦军，陈中建，陈 松，秦路平（.上海市皮肤病医院药剂科，上海 00；.第二军医大学药学院生药教研室，上海 00；.上海市皮肤病医院中心实验室，上海 00；.苏州市第五人民医院，江苏苏州 5000）

据预测2000－2050年，全球癌症新发患者将以每年2倍的速度递增，治疗费用在未来10年将增加800亿美元[1]，为改善肿瘤治疗现状，各国以及各大制药公司都在加大开发肿瘤药物的研发力度。自1971年Judan Folkman首次提出“肿瘤的生长和转移依赖于血管生成”的假说以来[2]，血管生成在肿瘤发展过程中的作用逐渐明朗。Douglas Hanahan和Robert A.Weinberg先后撰文描述肿瘤特征，将血管生成（Sustained Angiogenesis）学说明确提出[3]，揭示了血管生成在肿瘤生长中的重要地位。

知母皂苷AⅢ为中药知母中甾体皂苷类成分，近年来发现其对部分肿瘤细胞有很好的抑制作用：（1）通过线粒体介导诱发Hela肿瘤细胞凋亡[4]；（2）通过自噬机制抑制Hela肿瘤细胞生长[5]；（3）诱导人乳腺癌细胞BT474凋亡[6]；（4）诱导人结肠癌HCT-15细胞凋亡和阻止细胞周期；（5）抑制HCT-15细胞移植瘤动物模型的肿瘤生长[7]。

本研究采用人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），观察知母皂苷AⅢ对内皮细胞增殖和凋亡的影响，为研究其抗血管作用提供前期数据支持。

1 材料

1.1 仪器

HF90/HF240型CO2培养箱、生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司）；40R型低温高速离心机（美国Thermo Scientific公司）；EPICS XL分析型流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）；TS100型倒置显微镜（日本Nikon公司）；ELX800NB型酶标仪（美国Bio-Tek公司）。

1.2 药品与试剂

知母皂苷AⅢ（上海同田生物技术股份有限公司，批号：070503，纯度：≥98%）；MTT（美国Sigma公司）；RPMI Medium 1640、胰蛋白酶、胎牛血清（美国Gibco公司）；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡测试盒（南京凯基生物科技发展有限公司）。

1.3 细胞株

HUVEC由苏州市第五人民医院冯彦军医师馈赠。

2 方法

2.1 细胞培养

HUVECs于37 ℃下，在5%CO2培养箱中，以含10%胎牛血清的DMEM培养液培养。

2.2 MTT比色法检测细胞生长

收集对数期细胞，接种于96孔板，细胞密度为5 000/孔。于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，细胞贴壁24 h后，加入0（即空白对照）、1、2、4、8 μmol/L浓度的知母皂苷AⅢ，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24、48、72 h，每孔加入10 μl MTT溶液，继续培养4 h。吸去孔内培养液，每孔加入150 μl二甲亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶标仪490 nm波长处测定吸光度（A），计算细胞生长抑制率（%）。细胞生长抑制率（%）＝（空白对照A－用药A）/空白对照A×100%。

2.3 细胞形态学观察

收集对数期细胞，接种细胞于96孔板，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，细胞贴壁24 h后，加入0、1、2、4、8 μmol/L浓度的知母皂苷AⅢ，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24、48、72 h。倒置显微镜观察细胞形态。

2.4 流式细胞仪检测凋亡细胞

收集对数生长期细胞，接种于24孔板，分别加入0、4、8 μmol/L药物作用24 h后收集细胞，预冷的PBS洗涤细胞2次，用500 μl结合缓冲液重悬细胞，加入AnnexinV-FITC和PI各5 μl，混匀于室温避光孵育15 min，收集到流式管中，流式细胞仪检测细胞凋亡程度。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 知母皂苷AⅢ对HUVECs生长的抑制作用

终浓度分别为1、2、4、8 μmol/L的知母皂苷AⅢ作用HUVECs 24、48、72 h，细胞生长受到抑制，并与时间、浓度呈正比。计算可知，知母皂苷AⅢ作用HUVECs 24、48、72 h的半数抑制浓度（IC50）分别为7.2、4.0、2.0 μmol/L。知母皂苷AⅢ对HUVECs生长的抑制作用见表1。

表1 知母皂苷AⅢ对HUVECs生长的抑制作用（，n＝3）Tab 1 Inhibitin of timosaponin AⅢon the proliferation of HUVECs（，n＝3）

表1 知母皂苷AⅢ对HUVECs生长的抑制作用（，n＝3）Tab 1 Inhibitin of timosaponin AⅢon the proliferation of HUVECs（，n＝3）

与0 μmol/L比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.0 μmol/L：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

3.2 知母皂苷AⅢ对HUVECs细胞形态的影响

低倍镜（100×）可见，8 μ mol/L知母皂苷A Ⅲ处理HUVECs 24、48、72 h后细胞逐渐固缩，细胞减少。高倍镜（400×）可见，2 μmol/L知母皂苷处理AⅢHUVECs 24 h后逐渐出现空泡，4、8 μmol/L知母皂苷AⅢ处理HUVECs明显出现空泡。知母皂苷AⅢ对HUVECs细胞形态的影响见图1。

3.3 知母皂苷AⅢ对HUVECs凋亡的促进作用

知母皂苷AⅢ作用于HUVECs 24 h，其IC50为7.17 μmol/L，因此本研究选用接近IC50和2 IC50，即4、8 μmol/L知母皂苷AⅢ。与0 μmol/L比较，8 μmol/L浓度下知母皂苷AⅢ可明显提高HUVEC凋亡率（P＜0.05）。流式细胞仪检测结果见图2[图中左下象限显示活细胞（LL：Annexin Ⅴ－/PI－）；右下象限为早期凋亡细胞（LR：Annexin Ⅴ+/PI－）；右上象限为晚期凋亡细胞（UR：Annexin Ⅴ+/PI+）；而左上象限是非活细胞，即坏死细胞（UL：Annexin Ⅴ－/PI+）。凋亡细胞为右上象+右下象]；知母皂苷AⅢ对HUVECs凋亡的影响见表2。

4 讨论

本研究发现，知母皂苷AⅢ对体外培养HUVECs有明显抑制作用，细胞形态学观察也证明了这一点。高倍镜下可见从知母皂苷AⅢ2 μmol/L开始HUVECs即出现空泡，随着浓度的加大，空泡逐渐明显。李梢等[8-9]采用网络药理学方法发现知母皂苷AⅢ可能具有抗血管作用，并采用VEGF刺激内皮细胞过度增殖，发现其具有抑制作用，与本研究直接采用HUVECs观察到相同的现象，提示其抗血管作用可能不完全依赖血管内皮生长因子（VEGF），但尚需进一步实验验证。

已有研究显示，知母皂苷AⅢ能促进肿瘤细胞凋亡，但其抑制VEGF增殖的作用与促进细胞凋亡是否有关？为了验证此想法，笔者采用流式细胞仪检测其对HUVECs凋亡的影响，选用接近IC50和2 IC50，即4、8 μ mol/L知 母皂苷A Ⅲ作 用HUVECs 24 h后检测细胞凋亡。结果显示，知母皂苷AⅢ能诱导部分HUVECs凋亡，可初步推测其抑制内皮细胞增殖与诱导凋亡有关。

图1 知母皂苷AⅢ对HUVECs细胞形态的影响A.作用24、48、72 h（100×）；B.作用24 h（400×，箭头为细胞空泡）Fig 1 Effect of timosaponin AⅢon morphology of HUVECsA.treated for 24 h，48 h and 72 h（100×）；B.treated for 24 h（400×，arrowhead means cell vacuoles）

图2 流式细胞仪检测结果A.0 μmol/L；B.4 μmol/L；C.8 μmol/LFig 2 Results of flow cytometry testA.0 μmol/L；B.4 μmol/L；C.8 μmol/L

正常成人除了创伤愈合及生殖周期外，几乎所有新生血管生成都是病理性的，如肿瘤、风湿性关节炎、糖尿病及视网膜病变等[10]。笔者推测知母皂苷AⅢ对内皮系统的抑制作用有可能是其对血管增生性疾病具有广谱对抗作用。下一步需要加强血管增生性疾病动物模型及相关血管生成分子靶点的研究，以验证该假说。

表2 知母皂苷AⅢ对HUVECs凋亡的影响（，n＝3）Tab 2 Effect of timosaponin A Ⅲon the apoptosis of HUVECs（，n＝3）

表2 知母皂苷AⅢ对HUVECs凋亡的影响（，n＝3）Tab 2 Effect of timosaponin A Ⅲon the apoptosis of HUVECs（，n＝3）

与0 μmol/L比较：＊P＜0.05vs.0 μmol/L：＊P＜0.05

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