正交试验优选十一方药酒的超声提取工艺Δ

陈晓明，莫小林，韦振源，龚敏阳，陈 朝（广西中医药大学第一附属医院，南宁 530023）

十一方药酒（批准文号：桂药制字Z01060025）为我院制剂室的自制品种，由三七、重楼、大黄、红花、煅自然铜、乳香、秦艽、没药、续断、制马钱子等中药组成，临床用于治疗跌打扭伤，各种骨折、骨伤、风湿骨痛等症，疗效显著。目前，较常用的酒剂制备方法为浸渍法、渗漉法、回流提取法或其他适宜方法[1]。近年来，越来越多的学者利用超声波技术提取中药制剂[2-5]，该法具有处理时间短、提取效率高、操作简便等优点[6]。本研究采用单因素试验初步考察了超声波法提取十一方药酒的工艺参数，并以白酒体积分数、白酒用量、提取时间与提取次数为考察因素，以十一方药酒总固体量、人参皂苷Rg1与大黄酚含量为指标，采用正交试验法考察超声波提取十一方药酒的方法，以为十一方药酒的制备工艺选择提供科研依据。

1 材料

1.1 仪器

DCU-20A5型高效液相色谱仪、SPD-20A型紫外检测仪（日本岛津公司）；GH-252型电子分析天平（广州市艾安得仪器有限公司）；CD-UPT-II-10L型超纯水制造系统（成都超纯科技有限公司）；KQ3200E型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂

人参皂苷Rg1对照品（批号：110703-201027）、大黄酚对照品（批号：110796-201118）均购自中国食品药品检定研究院；十一方药酒（广西中医药大学第一附属医院制剂室，批号：20130507、20130523、20130611，规格：100 ml/瓶）；乙腈、甲醇、磷酸均为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 人参皂苷Rg1含量的测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱：WondaSil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.05%磷酸水溶液（22∶78，V/V）；检测波长：205 nm；流速：1.0 ml/min；进样量：20 μl；柱温：30 ℃。在此条件下人参皂苷Rg1可与其他峰完全分离，保留时间约为22.6 min，理论板数不低于5 000。

2.1.2 溶液的制备（1）对照品溶液的制备。精密称取2.0 mg人参皂苷Rg1对照品，置10 ml量瓶中，加甲醇制成每1 ml含0.20 mg人参皂苷Rg1的对照品溶液。（2）供试品溶液的制备。精密吸取3.0 ml十一方药酒，水浴蒸干至无醇味，加15 ml水溶解，滤过，滤液用乙醚萃取2次，每次10 ml，弃去乙醚液，水溶液用水饱和的正丁醇萃取3次，每次8 ml，合并正丁醇液，超声处理30 min，用5%NaOH溶液洗涤2次，每次10 ml，合并正丁醇液，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解于25 ml量瓶中，摇匀，0.45µm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 标准曲线的制备 精密吸取人参皂苷Rg1对照品溶液0.4、1.0、1.8、2.6、3.4 ml，置10 ml量瓶中，用甲醇定容，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，连续进样3次。以人参皂苷Rg1质量浓度（x）为横坐标，峰面积积分值（y）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为y＝1 390.2x+831.7（r＝0.99 80）。结果表明，人参皂苷Rg1质量浓度在8.0～68.0µg/ml范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.2 大黄酚含量的测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：WondaSil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（84 ∶16，V/V）；检测波长254 nm；流速：1.0 ml/min；进样量：20 μl；柱温：30 ℃。在此条件下大黄酚可与其他峰完全分离，保留时间约为13.7 min，理论板数不低于6 000。

2.2.2 溶液的制备（1）对照品溶液的制备。精密称取大黄酚对照品0.205 mg，置10 ml量瓶中，加甲醇制成每1 ml含20.5 μg大黄酚的对照品溶液；（2）供试品溶液的制备。精密吸取3.0 ml十一方药酒，水浴蒸干至无醇味，加入20 ml 10%盐酸溶液，超声处理30 min，用氯仿溶液萃取3次，每次10 ml，合并氯仿溶液，加2%碳酸钠溶液洗涤，弃去碳酸钠液层，氯仿层用20 ml水洗涤，弃去水层，氯仿层水浴挥干，用甲醇定容于10 ml量瓶中，摇匀，0.45µm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 标准曲线的制备 精密吸取0.1、0.3、0.8、1.4、2.0 ml大黄酚对照品溶液，置5 ml量瓶中，用甲醇定容，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以大黄酚质量浓度（x）为横坐标，峰面积积分值（y）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为y＝77 726x+7 175.1（r＝0.999 9）。结果表明，大黄酚质量浓度在0.41～8.20 µg/ml范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.3 总固体量的测定

精密量取各样品溶液50 ml，置已干燥至恒质量的蒸发皿中，水浴上蒸干，于105 ℃干燥3 h，移至干燥器中，冷却30 min，迅速精密称定质量，计算总固体量[7]。

2.4 超声波提取条件对提取效果的影响

2.4.1 浸泡时间考察 在一定条件下，先将十一方药酒原料药材用溶剂浸泡不同时间后超声波（150 W，40 kHz）提取，分别测定人参皂苷Rg1、大黄酚含量与总固体量。药材浸泡2 h所测得人参皂苷Rg1含量、大黄酚含量与总固体量均最高；3 h后随浸泡时间的延长，各含量有所下降。结果表明，在超声波提取前选择浸泡2 h即可。不同浸泡时间对十一方药酒提取效果的影响见表1。

2.4.2 药材粉碎度考察 在成药的制备过程中，中药有效成分的浸出常常与扩散面积（粉碎度）和扩散时间有关[8]。在超声波提取前先将十一方药酒原料药材粉碎成不同的粒度，分别测定不同粉碎度下超声波提取后药酒中人参皂苷Rg1、大黄酚含量与总固体量。药材粉碎成最粗粉时人参皂苷Rg1、大黄酚含量最高，总固体量接近高值。结果表明，超声波提取前药材粉碎成最粗粉（10目）为宜。不同粉碎度对十一方药酒提取效果的影响见表2。

表2 不同粉碎度对十一方药酒提取效果的影响Tab 2 Effect of different grinding degree on the extraction of Shiyifang vinum

2.4.3 白酒体积分数考察 在一定条件下，分别用45%、50%、60%、70%白酒超声波提取样品。在其他条件不变的情况下，50%白酒提取得到的各成分含量均最高，60%与70%白酒提取得到的各成分含量有所下降。结果表明，白酒体积分数以50%为宜。不同体积分数白酒对十一方药酒提取效果的影响见表3。

表3 不同白酒体积分数对十一方药酒提取效果的影响Tab 3 Effect of different liquor concentration on the extraction of Shiyifang vinum

2.4.4 料液比考察 十一方药酒不同料液比测定人参皂苷Rg1、大黄酚含量与总固体量。料液比在1 ∶5（g/ml）时，人参皂苷Rg1含量、大黄酚含量与总固体量均最高，当料液比超过1∶5（g/ml）时，各成分含量有所下降。结果表明，选择料液比1 ∶5（g/ml）较为合适。不同料液比对十一方药酒提取效果的影响见表4。

表4 不同料液比对十一方药酒提取效果的影响Tab 4 Effect of different solid-liquid ratio on the extraction of Shiyifang vinum

2.4.5 超声提取时间考察 在一定条件下，分别对十一方药酒进行45、60、75、90 min的超声提取。结果表明，在60 min时，人参皂苷Rg1、大黄酚的含量及总固体量为最高，超声时间延长其含量反而有所降低。不同超声提取时间对十方药酒提取效果的影响见表5。

2.4.6 提取次数考察 在一定条件下，测定十一方药酒不同提取次数人参皂苷Rg1、大黄酚的含量与总固体量。结果表明，超声波提取1次时人参皂苷Rg1、大黄酚的含量为最高，总固体量与提取2次接近。说明超声波提取1次已基本提取完全，从经济、时间、效率等综合考虑，选择提取次数为1次较为合适。不同提取次数对十一方药酒提取效果的影响见表6。

表5 不同超声提取时间对十一方药酒提取效果的影响Tab 5 Effect of different extraction time on the extraction of Shiyifang vinum

表6 不同提取次数对十一方药酒提取效果的影响Tab 6 Effect of different extraction times on the extraction of Shiyifang vinum

根据单因素试验结果可知，单因素试验的优化条件为药材粉碎成最粗粉（10目），浸泡2 h，白酒体积分数为50%，料液比为1∶5（g/ml），提取时间为60 min，提取次数为1次。

2.5 正交试验优选超声提取最佳工艺条件

在单因素试验基础上，以人参皂苷Rg1、大黄酚含量与总固体量为考察指标，白酒体积分数（A）、料液比（B）、提取时间（C）、提取次数（D）为考察因素，每个因素选取3个水平，采用L9（34）正交表进行试验。中药有效成分是中药复方发挥治疗作用的物质基础[9]，而总固体量影响制剂澄清度和成品稳定性。故选择人参皂苷Rg1、大黄酚作为评价指标权重系数均为0.4，总固体量作为评价指标权重系数为0.2，得到综合评分。因素水平见表7；正交试验结果见表8；方差分析结果见表9。

表7 因素与水平Tab 7 Factors and levels

表8 正交试验结果Tab 8 Results of orthogonal experiment

表9 方差分析结果Tab 9 Results of variance analysis

由表8、表9可知，影响十一方药酒超声波提取效果的因素顺序为A＞C＞D＞B，即白酒体积分数＞提取时间＞提取次数＞料液比。其中，因素A对试验结果有非常显著性影响；因素C对试验结果有显著性影响。结合溶剂回收、节约时间等因素，最终确定超声波提取最优工艺条件为A2B2C3D1，即料液比（1 ∶5）g/ml，50%白酒超声波提取1次，时间为75 min，这与前述单因素试验结果比较基本一致。

2.6 工艺验证试验

按超声波提取最佳工艺条件重复试验3次，测定人参皂苷Rg1、大黄酚含量与总固体量。使用最佳验证工艺参数，人参皂苷Rg1含量平均为0.445 mg/ml，RSD＝0.70%；大黄酚含量平均为22.10 µg/ml，RSD＝1.53%；总固体量均值为1.604 7 g，RSD＝0.71%。以上数据接近正交试验结果的最高值，说明正交试验结果可靠。

3 讨论

我院十一方药酒的制备方法为浸渍法，即将组方药物粉碎成粗粉，用50 ℃白酒密闭浸泡6个月，定期搅拌，滤过，灌装，用于院内临床使用，并获得了医院制剂批准文号（桂药制字Z01060025）。该法具有生产周期长，溶剂挥发较多，药液损耗大等缺点。方中三七、大黄为君药，三七有效成分为皂苷类，其中以人参皂苷Rg1等成分含量最高[10]。大黄具有清热泻下、抗菌、行淤化积、消炎止血、抗肿瘤等功效[11]。笔者已对浸渍法和回流法提取十一方药酒中人参皂苷Rg1的含量进行了测定[12-13]并与超声波提取进行比较。结果，超声波提取十一方药酒中的人参皂苷Rg1的含量较回流法高，较浸渍法高出2倍，且不需加热，减少了挥发性成分的损耗，提取时间也大大减少，只需75 min。

在超声提取时，为了避免白酒损失，用具塞三角烧瓶进行提取。测定人参皂苷Rg1时分别对乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液[14]、甲醇-水[15]等不同流动相及流动相的不同比例进行了考察，发现乙腈-0.05%磷酸水溶液（22 ∶78，V/V）作流动相时人参皂苷Rg1分离效果最好。在人参皂苷Rg1供试品溶液的制备中，还考察了不用碱洗、不同碱洗和碱洗浓度和次数，结果发现5%NaOH溶液洗2次，人参皂苷Rg1分离效果最好和含量最高。

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