氨基酸分析仪检测牛乳中掺入的大豆蛋白

于方园，岳喜庆*，武俊瑞，田 野

（沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866）

氨基酸分析仪检测牛乳中掺入的大豆蛋白

于方园，岳喜庆*，武俊瑞，田 野

（沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866）

利用氨基酸分析仪对牛乳和大豆分离蛋白中的17 种氨基酸进行分离测定，氨基酸浓度在0.025～0.350 μmol/mL时，其峰面积和氨基酸浓度的线性相关系数均不小于0.988，重复性较好，牛乳加标回收率范围在94.2%～103.1%，相对标准偏差在0.89%～3.31%。通过对比分 析 牛乳和大豆的氨基酸图谱找到含量差异较大的6 种氨基酸，并根据模 拟掺假实验样品的氨 基酸分析6 种氨基酸含量和掺假量的线性关系，相关系数R2达0.889，建立牛乳中大豆蛋白掺假的定性定量检测方法。

氨基酸分析仪；牛乳；大豆分离蛋白；掺假检测

随着人民生活水平的日益提高，鲜牛乳的消费量迅速增加，饮用鲜牛乳、纯牛乳已渐渐成为习惯[1]。在纯牛乳中非法添加大豆蛋白以提高蛋白质含量从而获得较高的经济效益，不仅降低了牛乳的营养价值[2]，也严重损害了广大消费 者的利益。因此，检测原料乳中掺入大豆蛋白对原料乳的质量控制有重要意义。目前的乳品蛋白质掺假检测方法涉及了色谱、质谱、免疫、聚合酶链式反应、电泳、光谱学、分析化学等技术领域[3]。王金敏等[4]利用传统的化学检测方法检测牛乳中的大豆蛋白，简单快速但只能定性不利于蛋白的定量检测[5]。吴茹怡[6]通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳中牛乳和大豆蛋白的条带对比可检测掺假量体积分数5%的豆浆，凝胶电泳耗时较长且检出限较低。李亮[7]、Luykx[8]、Lopez-Calleja[9]等分别利用近红外光谱法、高效液相色谱法以及聚合酶链式反应等结合化学测定方法或质谱法可以定性定量检测牛乳中的大豆蛋白，但是检测成本较高[10]。本实验使用氨基酸分析仪，利用牛乳和大豆蛋白质的氨基酸组成含量差异对牛乳中掺入的大豆蛋白进行定性定量检测，弥补了现有方法耗时长检测不灵敏的不足。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜牛乳（样品编号1～5，每个样品都为多头奶牛的混合常乳，奶牛品种为荷斯坦乳牛） 沈阳辉山牧场。

大豆分离蛋白S1 北京奥博星生物技术有限责任公司；大豆分离蛋白S2 西亚试剂公司；大豆分离蛋白S3古神生物科技集团有限公司；17 种氨基酸标样及正亮氨酸 美国Sigma公司；盐酸（优级纯）；实验室用水为超纯水；氨基酸分析仪配套的流动相（缓冲液和茚三酮溶液）。

1.2 仪器与设备

L-8800型氨基酸分析仪及数据处理平台 日本日立公司；KQ-250B型超声波清洗器 昆山超声仪器有限公司；凯氏定氮装置、高速冷冻离心机 上海卢湘仪器有限公司；均质仪 美国Omin公司。

1.3 方法

1.3.1 牛乳样品前处理

5 种鲜牛乳在4 ℃条件下，5 000 r/min离心30 min[11]，去除上层脂肪得到脱脂牛乳，编号为鲜牛乳1～5。

1.3.2 蛋白质含量的测定

凯氏定氮法[12]分别测脱脂后的5 种鲜牛乳和3 种大豆分离蛋白的蛋白质含量。

1.3.3 模拟掺假实验

取牛乳1分别添加10%、5%、2%、1%、0%的大豆分离蛋白S1（每个掺假样品的蛋白质含量保持一致），将以上样品经均质仪反复均质3 次，再经涡轮搅拌过夜备用[13]。掺假牛乳2～5处理方法同掺假牛乳1。

1.3.4 样品处理[14-17]

取2.5 mL液体样品（0.100 g固体样品）于水解管中加10 mL 6 mol/L盐酸滴入正辛醇充氮后封管置于110 ℃烘箱中保持24 h，冷却后经滤纸过滤到50 mL容量瓶中用超纯水反复冲洗水解管及滤纸最后定容。取 1 mL的样液于蒸发皿中在蒸气浴上蒸干，然后加0.02 mol/L盐酸2.5 mL溶解用针管过滤器过滤，备用上机。

1.3.5 色谱条件[18-22]

荧光激发波长338 nm；荧光发射波长425 nm；柱温62 ℃；反应器35 ℃；进样量10 μL；流速0.4 mL/min；柱后泵流速0.4 mL/min；流动相配制见表1，梯度洗脱程序见表2。

表1 流动相的配制Table 1 Preparation of mobile phase

表2 梯度洗脱程序Table 2 Gradient elut ion program

1.3.6 氨基酸标准曲线的绘制

将氨基酸混合标准液配制成浓度分别为0.025、0.050、0.100、0.150、0.200、0.250、0.300、0.350 μmol/mL的溶液，利用正亮氨酸内标法[23]，以每一种氨基酸峰面积与内标正亮氨酸峰面积之比为纵坐标，氨基酸标样浓度为横坐标，得到回归方程、相关系数及线性范围，每一种标准液都按1.3.5节色谱条件进行上机测定。

1.3.7 方法精密度、稳定性及重复性实验

取标准品混合溶液，经处理后连续进样6 次以及分别在0、2、4、8、12、24 h进样，以色谱峰峰面积为指标计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），考察精密度及稳定性。取同一种牛乳6 份，处理后进样，以同样方法计算 RSD，考察方法的重复性。

1.3.8 加标回收率实验

精密称取适量牛乳，按1.3.4节方法处理样品，分别加入一定量的氨基酸混合标准溶液，进行上机分析平行6 次，进行加标回收率的测定。

2 结果与分析

2.1 蛋白质含量

通过凯氏定氮法测得的样品蛋白质含量见表3。

表3 样品蛋白质含量Table 3 Protein content of milk and soybean protein isolate g/100 g

2.2 氨基酸标样的回归方程、相关系数和线性范围

图1 17 种氨基酸标准品混合溶液的色谱图Fig.1 Chromatograms of 17 amino acid standards

17 种氨基酸标准色谱图见图1。按照1.3.6节方法得到各氨基酸的工作曲线和回归方程、相关系数R2及线性范围见表4，氨基酸浓度在0.025～0.350 μmol/mL时，其峰面积和氨基酸浓度的线性相关系数均不小于0.988，相关性较好。

表4 17 种氨基酸的线性回归方程Table 4 Linear regression equations of 17 amino acids

2.3 方法精密度、稳定性及重复性实验

17 种氨基酸标准溶液的精密度实验，RSD在0.89%～2.11%（n=6）；稳定性实验RSD在 0.67%～2.07%（n=6），均在允许范围内。17 种氨基酸的峰面积的RSD在1.20%～2.58%。说明此方法精密度高，重复性好且稳定，可应用于样品中17 种氨基酸的分析。

2.4 加标回收率实验

表5 17 种氨基酸的回收率（n=6）Table 5 Mean recoveries for 17 amino acids (n= 6) %

表5表明牛乳中氨基酸的平均 回收率在94.2%～103.1%，RSD在0.89%～3.31%均在允许范围内，结果较好。

2.5 氨基酸图谱对比

图2 牛乳1水解液氨基酸的色谱图Fig.2 Chromatograms of amino acids in the milk1

图3 大豆分离蛋白S1水解液氨基酸的色谱图Fig.3 Chromatograms of amino acids in the soybean protein isolated 1

表6 大豆蛋白和牛乳水解后的氨基酸平均值Table 6 Average amino acid contents of hydrolyzed milk and soybean protein

实验对5 个牛乳样品和3 种购于不同厂家的大豆分离蛋白进行了氨基酸测定，对比氨基酸的指纹图谱，发现不同样品牛乳各峰的保留时间、面积基本一致，不同大豆分离蛋白的氨基酸图谱基本相似。说明这一牧场的牛乳水解的各种氨基酸含量组成基本接近，不同种大豆分离蛋白的氨基酸含量组成相差不大。牛乳1的氨基酸图谱见图2，大豆分离蛋白S1图谱见图3。通过对大豆分离蛋白和牛乳氨基酸图谱中各个峰的面积及保留时间的比较和表6中对大豆分离蛋白和牛乳水解后的氨基酸含量的比较综合发现大豆分离蛋白水解后的天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、精氨酸明显高于牛乳，赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、半胱氨酸则是牛乳水解液中较多，苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸等在牛乳和大豆分离蛋白中相差不大。

2.6 检测牛乳中掺入大豆蛋白的方法的建立

2.6.1 掺假牛乳中6 种氨基酸含量与大豆蛋白添加量的关系

根据2.5节的结论可以假设随着大豆分离蛋白在牛乳中添加量的增加，天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、精氨酸在牛乳中的含量也随之增加。由图4可知，6 种氨基酸含量与大豆蛋白添加 量都存在着一定的线性关系。

图4 掺假牛乳1中6 种氨基酸含量与大豆蛋白添加量的线性关系Fig.4 Linear relationship between the individual contents of 6 amino acids in adulterated milk 1 and the amounts of added soybean protein isolate

表7 掺假牛乳1中6 种氨基酸含量与大豆蛋白添加量的线性方程Table 7 The linear equation between the contents of 6 amino acids in the adulterated milk 1 and the appending proportion of soybean protein isolated

2.6.2 掺假牛乳中6 种氨基酸含量和与大豆蛋白添加量的关系

对牛乳1的每种掺假水平下的6 种氨基酸含量和与大豆蛋白的添加量作图见图5，得到氨基酸含量和与大豆分离蛋白添加量的线性方程y=0.062x+6.625 其中R2=0.944，相关性较好。按照此方法，对牛乳2～5中的6 种氨基酸含量和与大豆蛋白的添加量作图见图6，可以看出每一种牛乳的氨基酸含量和与大豆分离蛋白的添加量都具有线性关系，牛乳4的相关性最好R2=0.975，而牛乳2的相关最低但也达到了0.845，牛乳3和牛乳5的相关系数也都在0.900以上。

图5 掺假牛乳1中6 种氨基酸含量和与大豆蛋白添加量的线性关系Fig.5 Linear relationship between the total content of 6 amino acidsin adulterated milk 1 and the amounts of soybean protein isolate

2.6.3 线性关系的确定

由2.6.2节可知，每种掺假牛乳的掺假量都可以通过特定的6 种氨基酸含量和进行检测。而由2.5节可知，辉山牧场不同的牛乳氨基酸的组成比例也基本相同，那么若将这5 种牛乳综合起来得到的线性关系则更具代表性，以牛乳中大豆分离蛋白添加量与5 种牛乳的6 种氨基酸含量线性关系见图7。5 种牛乳综合后的氨基酸含量与大豆分离蛋白的添加量呈线性关系，线性方程为y=0.061x+ 6.586，R2=0.889，相关性较好。

图7 掺假牛乳中6 种氨基酸含量和与大豆蛋白添加量的线性关系Fig.7 Linear relationships between the total content of 6 amino acids in adulterated milk and the amounts of added soybean protein isolate

3 结 论

利用氨基酸分析仪对牛乳、大豆、掺假样品中17 种氨基酸进行分析，方法简单，准确度、重复性和稳定性较好。取自同牧场同品种乳牛的常乳样品氨基酸图谱相似，氨基酸组成和比例基本一致；不同厂家的大豆分离蛋白的氨基酸图谱及含量差别不大，说明实验具有一定的区域代表性。不同的牛乳样品通过模拟掺假实验，以掺假样品中的6 种氨基酸（天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、精氨酸）含量为横坐标以掺假的大豆分离蛋白占样品总蛋白的百分比为纵坐标得到线性方程y=0.061x+6.586，R2=0.889重复性较好，即可通过样品中特定氨基酸含量和推算出掺入大豆蛋白的比例，从而建立了纯牛乳中大豆蛋白掺假的定量检测方法，且大豆蛋白掺假量在总蛋白含量的1%以上时，此法就可有效地进行检测，方法简单，灵敏度高。本研究为牛乳中大豆蛋白的掺假检测提供了创新方法，对更广阔区域内的牛乳和其他类蛋白质掺假还有待进一步的验证和探索。

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Detection of Soybean Protein in Adulterated Milk by Amino Acid Analyzer

YU Fang-yuan, YUE Xi-qing*, WU Jun-rui, TIAN Y e
(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

The separation and analysis of 17 amino acids in milk protein and soybean protein were conducted by amino acid analyzer. When the concentrations of amino acids were in the range of 0.025–0.350 μmol/mL, the correlation coefficients between peak areas and amino acid co ncentrations were above 0.988, th e calibration curves of 17 amino acids all exhibited good linearit y and repeatability. Mean recovery rates and relative standard derivations (RSDs) for 17 amino acids from spiked samples were in the ranges of 94.2% to 103.1%, and 0.89% to 3.31%, respectively. The linear relationship between the contents of 6 selected amino acids showing significant differences in the amino acid profiles of the two proteins and the amounts of added soybean protein was established by adulteration simulation experiments with correlation coefficients above 0.889. This study has provided a good method for qualitative and quantitative detection of soybean protein adulterated milk.

amino acid analyzer; adulterated milk; soybean protein isolated; detection

TS207.3

A

1002-6630（2014）22-0238-05

10.7506/spkx1002-6630-201422046

2013-11-06

于方园（1988—），女，硕士研究生，研究方向为动物性食品科学利用技术。E-mail：410601479@qq.com

*通信作者：岳喜庆（1966—），男，教授，博士，研究方向为畜产品加工。E-mail：yxqsyau@126.com