实时荧光聚合酶链式反应法检测食品中猫源性成分

高晓丽，杨昕霆，王 丹，赵琳娜，陈吉汉，侯彩云,*

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，教育部-北京市共建功能乳品重点实验室，北京 100083；2.北京市食品安全监控中心，北京 100041）

实时荧光聚合酶链式反应法检测食品中猫源性成分

高晓丽1，杨昕霆2，王 丹2，赵琳娜2，陈吉汉1，侯彩云1,*

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，教育部-北京市共建功能乳品重点实验室，北京 100083；2.北京市食品安全监控中心，北京 100041）

根据猫线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化还原酶亚基1（ND1）基因中的保守序列设计猫特异性引物和TaqMan探针，建立食品中猫源性成分的实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测方法。通过实时荧光PCR反复验证，结果表明，引物和TaqMan探针对猫源性成分的特异性良好，检测灵敏度可达1 pg，适用于食品中猫源性成分的快速鉴定。通过对随机抽取的市售肉制品的检测，尚未发现掺有猫源性成分的行为。

实时荧光聚合酶链式反应；线粒体ND1基因；猫源性成分

动物源性食品由于其富含蛋白质、脂肪、维生素和矿物质等营养成分，在日常饮食中所占的比例越来越大。但是，国内外不断报道的食品安全问题，尤其是肉制品的掺假掺杂，不仅严重侵害了消费者的健康和权益，同时直接影响到国家的形象、社会的和谐发展以及政府的公信力[1]，甚至因宗教因素导致的民族矛盾。因此，有必要建立快速、准确、高效的食品中动物源性成分筛查方法，对未知成分的动物源性食品进行快速筛查。

目前，国内外学者主要利用以实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）为基础的检测技术对动物源性物种成分的鉴定进行研究，大量报道了普通PCR和实时荧光PCR法检测食品中猪肉、牛肉、山羊肉、绵羊肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、火鸡肉、马肉、驴肉、骆驼等常见的肉类物种[2-15]，以及食品中鸟类、鱼类的检测[16-19]。与普通PCR相比，实时荧光PCR法特异性强、灵敏度高、准确性好；反应过程中反应管保持封闭，大大减少了外来污染；扩增产物无需电泳，检测自动化程度较高，分析快速，能同时进行多个物种的高效筛选；能够实时监测每个扩增循环，可实现定性、定量检测。因此，实时荧光PCR技术被认为是肉品鉴定中最有潜力的分子学检测工具[20]。

国内外虽有大量PCR法检测肉制品中物种成分的研究报道，但针对猫源性成分鉴定的还不多。Martín等[20]建立了食品和饲料中猫、狗、鼠源性成分鉴定的普通PCR方法，检测限为0.1%。国内仅有张舒亚等[21]以12S rRNA为靶标设计了引物和TaqMan探针，建立了食品和饲料中猫源性成分的实时荧光PCR检测方法，可检出动物和植物材料基质中0.01%的猫源性成分。尚未有针对猫线粒体ND1基因为靶标的实时荧光PCR方法，而动物线粒体ND1基因进化速率快[14]，可以更好地与其他物种进行区分。因此，本研究设计了猫线粒体ND1基因特异性引物和TaqMan探针，建立了食品中猫源性成分的实时荧光PCR检测方法，实现快速、高效、准确地检测肉制品中的物种成分，从而为保障食品质量安全、打击掺假掺杂违法行为提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪肉、牛肉、山羊肉、绵羊肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、鸽子肉、鹌鹑肉、兔肉等动物材料购自北京市农贸市场或超市；骆驼肉、马肉、驴肉、鹿肉、狗肉、猫肉等动物材料为实验室自存。15 个牛羊肉串样品购自北京市农贸市场。

Tris-平衡酚、氯仿（三氯甲烷）、无水乙醇、异丙醇、乙酸钠均为国产分析纯；十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）提取缓冲液（20 g/L CTAB、1.4 mol/L NaCl、0.02 mol/L Na2EDTA、0.1 mol/L Tris-HCl、pH 8.0）、Tris -乙二胺四乙酸缓冲液（Tris-ethylene diamine tetra-acetic acid buffer，TE）（10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1 mmol/L EDTA）由本实验室配制；实时荧光PCR预混合液（Premix Ex TaqTM） 宝生物工程（大连）有限公司；猫ND1基因序列特异的上下游引物、TaqMan探针，由北京赛百盛基因技术有限公司合成。

1.2 仪器与设备

QIA Cube核酸自动提取仪 美国QIA Gene公司；核酸蛋白定量分析仪 德国Eppendorf公司；MyiQ单色实时定量PCR仪 美国伯乐公司；3K18冷冻离心机 德国Sigma公司；Biomedical freezer超低温冰箱（－40 ℃）日本Sanyo公司；Mili-Q纯水器 美国Milipore公司。

1.3 方法

1.3.1 动物组织DNA的提取

用灭菌手术剪分别剪取一定量的猪肉、牛肉、山羊肉、绵羊肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、鸽子肉、鹌鹑肉、兔肉、骆驼肉、马肉、驴肉、鹿肉、狗肉、猫肉的肌肉组织，剪碎置于研钵中（注意防止交叉污染）；加入石英砂，用液氮充分研磨至粉末状，迅速取2 g左右于2.0 mL离心管中，立即加入1 mL CTAB，混匀；置于核酸自动提取仪中加热振荡，消化30 min；离心取600 μL上清液于新的2.0 mL离心管中，加入等体积的氯仿和Tris-平衡酚各300 μL，用力振荡5 min，使其充分反应，12 000 r/min室温离心10 min；取上清液，加入600 μL氯仿，同上，12 000 r/min室温离心10 min；取上清液，加10%体积3 mol/L乙酸钠和2 倍体积无水乙醇，轻缓颠倒数次，可见白色絮状DNA，12 000 r/min室温离心10 min，弃上清液；加入1 mL 70%乙醇洗涤沉淀2 次，12 000 r/min室温离心10 min，弃乙醇；待DNA沉淀干燥后，将DNA溶于50～100 μL TE溶液或无菌水中；核酸蛋白定量分析仪测定浓度，琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，置于4 ℃冰箱备用，或于－20 ℃保存。

1.3.2 实时荧光PCR引物与TaqMan探针的设计

根据GenBank基因数据库已发表的猫（Felis silvestris catus）线粒体序列（Accession NO：NC_001700，GI：5835205）和猪、牛、山羊、绵羊、鸡、鸭、鹅、鸽子、鹌鹑、兔、骆驼、马、驴、鹿、狗的线粒体序列，分析生物进化树的规律，使用DNAMAN软件比对以上基因序列，寻找种内保守、种间差异较大的基因片段。应用Primer Express软件对各物种选取的特定序列进行引物、TaqMan探针的设计。最终设计的引物和探针经过BLAST比对，进一步验证引物和探针的特异性。本研究最终选取猫ND1基因序列设计了猫特异性引物和探针，既可以保证种内保守，又能保证种间特异。扩增产物长度为100 bp左右。

1.3.3 引物和TaqMan探针的验证

以猫肉线粒体DNA为阳性对照，猪肉、牛肉、山羊肉、绵羊肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、鸽子肉、鹌鹑肉、兔肉、骆驼肉、马肉、驴肉、鹿肉、狗肉的线粒体DNA为阴性对照。DNA模板的质量浓度均稀释至100 ng/μL，分别加入猫线粒体ND1基因特异性引物、TaqMan探针，以验证特异性，空白对照中以无菌水代替DNA模板。实时荧光反应体系为20 μL，具体包括： Premix Buffer（2×）10 μL、上游引物（10 μmol/L）0.5 μL、下游引物（10 μmol/L）0.5 μL、TaqMan探针1 μL、DNA 模板1 μL、无菌水将体系补充至总体积20 μL。实时荧光PCR扩增条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 个循环；72 ℃延伸10 min。

在实时荧光PCR检测方法中，Ct值是指每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。以Ct值35为界限，根据实时荧光PCR仪所得的Ct值来验证引物与探针对猫源性成分的特异性。

为检测方法的灵敏度，将猫肉基因组DNA溶液分别稀释为100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.000 01 ng/μL，各个质量浓度进行3 次重复实验，设置空白对照。根据各梯度的扩增曲线，建立Ct值-模板DNA质量浓度对数值的标准曲线，用于猫源性成分的灵敏度检测。

1.3.4 市售肉制品中猫源性成分的检测

从北京超市和农贸市场中随机取样15 个羊肉串，检验是否掺杂猫肉。首先提取所有的羊肉串样本DNA，然后按照实时荧光反应体系，设置阳性对照、阴性对照和空白对照，进行实时荧光PCR反应。

2 结果与分析

2.1 利用设计的引物进行普通PCR产物的测序结果

利用本研究设计的引物对猫肉DNA以及猪肉、牛肉、山羊肉、绵羊肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、鸽子肉、鹌鹑肉、兔肉、骆驼肉、马肉、驴肉、鹿肉、狗肉进行普通PCR反应，通过DNA琼脂糖凝胶电泳检测发现，只扩增了猫肉基因组DNA。将猫肉DNA扩增产物送往上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。利用GenBank中的BLAST功能对测序结果进行同源性搜索，结果只出现了一条猫基因序列的比对信息，同源性为93%，由此可以确定物种的真实性。而且，DNA质量能够保证实时荧光PCR的正常进行，这与实验预期相符合，可以进一步进行TaqMan实时荧光PCR。测序比对结果见图1。

图1 猫源性成分PCR产物的测序结果Fig.1 Sequencing of PCR products of feline DNA

2.2 引物和TaqMan探针的特异性检测结果

引物和TaqMan探针是以猫线粒体ND1基因为靶序列所设计的。实验表明，猪肉、牛肉、山羊肉、绵羊肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、鸽子肉、鹌鹑肉、兔肉、骆驼肉、马肉、驴肉、鹿肉、狗肉等动物材料DNA模板和空白对照所扩增的曲线Ct值均大于40，而猫肉DNA扩增曲线的Ct值为17。说明该体系对猫源性成分的检测具有良好的特异性。特异性实验扩增曲线如图2所示。

图2 猫引物探针实时荧光PCR的特异性检测结果图Fig.2 Specificity of real-time PCR for detection of cat-derived components

2.3 灵敏度检测结果

对猫肉基因组不同梯度的DNA溶液进行实时荧光PCR检测（表1），其中，100、10、1、0.1、0.01、0.001 ng/μL的DNA模板均有扩增，且Ct值在35之内，0.000 1 ng/μL质量浓度的扩增曲线Ct值略大于35，而0.000 01 ng/μL质量浓度的猫肉DNA未出现扩增。因此可知，猫源性成分的引物、TaqMan探针检测灵敏度为1 pg（0.001 ng/μL，相当于0.001%）。当实时荧光PCR反应处于指数期阶段，所有DNA模板的反应效率稳定且近似相等，DNA质量浓度的对数值与到达阈值时的循环数Ct值呈线性关系。为检测实时荧光PCR法的灵敏度及其线性范围关系，建立Ct值-模板DNA质量浓度对数值的标准曲线，见图3。由图3可知，该曲线线性相关度良好，R2为0.999，灵敏度可低至1 pg。根据PCR扩增效率计算公式，扩增效率/% =（－1+10[-1/slope]）×100，其中slope为斜率，可得PCR扩增效率是96%。

表1 猫DNA引物、探针体系的灵敏度检测结果Table 1 Sensitivity obtained with the species-specific primer-probe sets for detection of cat-derived components

2.4 市售食品中猫源性成分检测

为进一步验证猫引物探针体系的实际应用能力，对市场上抽检的15 个羊肉串进行是否掺杂猫源性成分的鉴定。结果显示，阳性对照的扩增曲线正常，阴性对照未扩增曲线，检样也未出现扩增曲线，表明15 个羊肉串中不含猫源性成分。

3 讨 论

实时荧光PCR检测方法由于其灵敏度、准确性、重复性参数上具有无可比拟的优势[23]，因而得到了广泛的应用。在实时荧光PCR法的检测中，国内外学者主要以线粒体cytb、D-loop、12S rRNA、16S rRNA等基因作为靶序列来设计引物和TaqMan探针，主要是因为线粒体DNA是高等动物唯一的核外遗传物质，是检测中比较理想的靶基因，而且细胞中均含有大量的线粒体。本研究通过大量筛选猫线粒体中的不同基因，并将设计的引物和探针序列在NCBI的BLAST中搜索、比对，最终在猫线粒体ND1基因位点上，发现既可以保证种内保守，又可保证种间特异的引物和探针序列，从而建立了针对猫源性成分的实时荧光PCR定性检测方法。该方法可以很好地特异性扩增出目标产物，常见的畜禽类物种DNA模板均未扩增，Ct值-模板DNA质量浓度对数值标准曲线的线性关系良好（R2≥0.990），灵敏度可达1 pg，PCR扩增效率为96%。

动物的不同组织中线粒体数量有区别，比如，心脏和肝脏等组织的线粒体就多于普通肌肉组织，或加工程度不同可能会导致荧光PCR定量结果的偏差，只能判断大致含量，但定性结果可靠。本实验中，猫线粒体DNA在提取后，需反复实验来验证结果，若DNA多次反复冻融容易降解，所以应该及时进行实时荧光PCR的反复验证实验，减少由于DNA的降解对实验结果造成假阴性的影响。

总之，本研究建立的针对猫源性成分的实时荧光PCR定性检测方法特异性良好、灵敏度较高、重复性好、实用性强。这对食品中猫源性成分掺假掺杂的检测具有重要意义，可作为食品中猫源性成分检测方法之一，同时为保障食品安全、打击掺假的违法行为提供技术参考。

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Detection of Cat-Derived Components in Foods by Real-Time Polymerase Chain Reaction

GAO Xiao-li1, YANG Xin-ting2, WANG Dan2, ZHAO Lin-na2, CHEN Ji-han1, HOU Cai-yun1,*
(1. Key Laboratory of Functional Dairy, Co-constructed by Ministry of Education and Beijing Municipality, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China; 2. Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring, Beijing 100041, China)

In this study, a TaqMan-based, sensitive and specific real-time polymerase chain reaction (PCR) assay was developed for the detection of cat-derived components in foods. Primers and TaqMan probe were designed based on the conserved sequence of the feline mitochondrial ND1, and the performance of the method was invalidated. Results indicated that no cross-reaction was observed between the feline and non-target species, and this method revealed a high sensitivity and could detect 1 pg of cat template DNA. In conclusion, the TaqMan probe assay used in this study can be a rapid and sensitive method for the routine identification of meat species in foods.

real-time PCR; mitochondrial ND1; cat-origin component

TS201.6

A

1002-6630（2014）24-0235-04

10.7506/spkx1002-6630-201424045

2014-03-17

北京市科技计划课题（Z131100005613005）

高晓丽（1990—），女，硕士研究生，研究方向为食品质量安全检测。E-mail：xiaoligao606@163.com

*通信作者：侯彩云（1963—），女，教授，博士，研究方向为食品科学与加工技术。E-mail：cyhou@cau.edu.cn