模拟酸雨胁迫对菲白竹生理特性的影响1)

王 涛 张珊珊 谢寅峰 田雪瑶 唐颂豪 季晓钒

(南京林业大学，南京，210037)

责任编辑:任 俐。

酸雨是pH ＜5.6 的大气降水的总称，包括各种酸性的雨、雾、雪、霜等形式［1］。随着现代经济的不断发展，化石燃料的使用日益增多，燃烧过程中排放的硫氧化物和氮氧化物不断积累，在大气中反应生成硫酸和硝酸，这些酸性物质随着雨雪等从大气层降落，形成酸雨［2－3］。酸雨危害导致的经济损失和对生态平衡及植物造成的严重影响使其成为全球备受关注的环境问题。作为燃煤大国，我国已经成为继欧美之后的世界第三大酸沉降区，而且存在不断发展的趋势［4－5］。江苏是中国酸雨污染较为严重的地区之一，四季均为酸性降水，酸性污染以硫酸型为主，且自北向南逐渐增加［6－7］。研究酸雨对植物的危害、如何防治及治理酸雨成为亟待解决的问题。

竹类植物作为重要的禾本科经济植物，具有用途广，繁殖快，适应力强，资源丰富，经济效益、社会效益和生态效益显著的优点［8］。我国竹类资源丰富，生态适应性强，大多是理想的绿化、美化竹种，具有其他绿化树种难以替代的优势。因此，竹类植物的抗性生理研究具有重要的现实意义。目前，有关竹类植物抗旱［9］、耐盐［10］、抗寒性［11］等方面的研究已有不少报道，但有关其对酸雨胁迫适应性的研究尚少，其对酸雨胁迫的抗性生理机制尚不清楚。菲白竹为禾本科苦竹属植物，植株低矮，叶色秀美，因叶面上有白色或淡黄色纵条纹而得名，是观赏竹类中不可多得的二色叶珍稀竹种。菲白竹原产日本，现在中国华东地区常被用于地被绿化或盆栽观赏，具有很强的适应能力，且耐修剪，病虫害极少发生［12］。文中通过人工模拟酸雨处理，研究菲白竹对高频度酸雨胁迫的生理响应以及解除胁迫后植株自身的生理恢复特性，研究结果为了解竹类植物耐酸雨胁迫能力及其生理适应机制提供依据，同时也为竹类植物的生态园林工程应用提供参考。

1 试验地概况

试验地位于南京林业大学北大山竹类植物园，该植物园位于北纬32°5'1″～32°5'11″，东经118°48'59″～118°49'40″。年平均气温为15.4 ℃，极端最高气温40.7 ℃，极端最低气温－14.0 ℃，年均降水量1 026.1 mm，无霜期237 d，属北亚热带季风气候区，土壤为下蜀系黄棕壤，pH 值6.56。

2 材料与方法

试验于2012年9—11月份进行，以菲白竹(Pleioblastus fortunei)为供试竹种。

在样地上设置4 个处理，分别为:清水(对照)，pH=4.0、pH=3.0、pH=2.0 模拟酸雨处理，每种处理设置3 个重复试验小区，随机区组排列，不同小区之间用塑料薄膜隔开。每小区选取2年生、高度及生长状况较为一致的健壮竹株10 株，对当年生第3分枝(由上往下)充分伸展且生长良好的叶片进行定位标记，用以各项指标的测定及外部观察。

模拟酸雨处理:根据江苏环境监测酸雨的结果，并参照谢寅峰等［8］方法，按摩尔比M(SO2－4)∶ M(NO3－)=5∶ 1 配置成模拟酸雨母液，再用蒸馏水稀释成pH 值分别为2.0、3.0、4.0 的酸雨溶液，对照为蒸馏水。2012年9月20日至9月22日，连续3 d于08:00 及17:00 左右对各实验区进行叶面喷淋，每次均喷至叶片滴液为度。每小区每次喷洒量为300 mL，对照区喷洒等量蒸馏水。喷淋期间以及恢复期内用塑料薄膜遮蔽自然降水，并且适当补充水分。处理后于2012年9月24日、10月5日、10月26日，分别取样，用于各项生理指标的测定，每个处理各指标测定重复5 次。

测定指标及方法:超氧化物岐化酶(SOD)活性的测定采用李合生［13］的方法，过氧化物酶(POD)活性的测定采用愈创木酚法［14］;叶绿素相对含量测定采用SPAD－502 叶绿素仪进行联体测定［15］;可溶性蛋白质量分数的测定采用考马斯亮蓝G －250 显色法［16］;细胞膜透性的测定按谭常等［17］的方法;丙二醛(MDA)质量摩尔浓度测定的方法为硫代巴比妥酸法［13］。

数据处理方法:所有数据均通过Excel 2003 进行整理，利用SPSS 17.0 统计分析软件进行数据的处理与分析。

3 结果与分析

3.1 外部形态观察结果

外部形态特征的变化是环境胁迫对植物影响最为明显的表现。外观观察表明，高频度酸雨胁迫处理后，不同胁迫处理的菲白竹叶片均出现不同程度的伤害症状，表现为竹叶表面逐渐出现黄褐色大小不一的斑点，多集中在主脉和叶尖附近，且随着酸雨胁迫强度的增加斑点数目增多、面积增大、颜色变深。解除胁迫后经过1 个月左右的定期观察发现，pH=2.0 处理组的叶片出现大面积、散生的坏死斑，且随着时间的延长，伤斑颜色逐渐变深，导致叶片褪绿并出现少量叶片脱落现象;pH =3.0 处理组的叶片叶缘和叶脉之间产生黄褐色不规则的较小的坏死斑点，但伤害程度和伤害面积与恢复初期相比并无加重，且叶片无脱落现象;而pH =4.0 处理组叶片在经过1 个月左右的恢复期后基本恢复正常，且并未出现明显的伤害症状。

3.2 模拟酸雨胁迫对菲白竹叶片叶绿素相对含量的影响

叶绿素是植物光合作用的物质基础，它可以将捕获的光能转化为化学能。当植物处于逆境时，叶绿素相对含量会发生相应的变化，进而影响到逆境中植物的光合作用能力。由表1可知，菲白竹遭受酸雨胁迫时，其叶片叶绿素相对含量会产生不同程度的下降，且酸度越强，降幅越明显。恢复初期，pH=4.0、pH=3.0、pH=2.0 处理组叶绿素相对含量比对照分别降低了10.41%、17.77%、25.58%。经过13d 的恢复期后，pH=4.0 组变化不明显，pH=3.0、pH=2.0 组小幅降低，分别达到对照的79.69%、71.71%。到了10月26日，pH=4.0 处理组已经基本恢复到对照水平，pH =3.0 组变化不显著，但pH=2.0 组继续下降，仅达到对照的69.88%。多重对比分析表明，恢复初期，各处理组与对照之间均达到显著水平(P ＜0.05)。但到了10月26日，pH =4.0组与对照差异不显著(P ＞0.05)，pH =3.0、pH =2.0 组与对照之间差异显著(P ＜0.05)，且pH =3.0、pH=2.0 组之间差异显著(P ＜0.05)。

3.3 模拟酸雨胁迫对菲白竹叶片可溶性蛋白质量分数的影响

植物体内的可溶性蛋白大多数是参与各种代谢的酶类，其质量分数是了解植物总代谢水平的一个重要指标。由表1可知，高频度酸雨胁迫下菲白竹的可溶性蛋白质量分数呈明显降低的趋势，且酸度越大，下降幅度越大。而随着恢复时间的延长，各处理组的可溶性蛋白质量分数有不同程度的升降。具体表现为胁迫解除后的第2 天，pH =4.0、pH =3.0及pH=2.0 处理组的可溶性蛋白质量分数降幅显著，且分别比对照下降了17.15%、33.88%和50.41%。10月5日，各处理组并没有产生明显的恢复或者进一步下降趋势。但经过一个月左右的恢复期后，pH=4.0 组已经基本恢复到对照水平。pH=3.0组小幅升高，达到对照的68.50%。而pH =2.0 处理组的可溶性蛋白质量分数下降到对照的41.88%。方差分析表明，9月24日，各处理组与对照差异均达到显著水平(P ＜0.05)。但到了10月26日，pH=4.0 组与对照组差异不显著(P ＞0.05)，pH=2.0、pH=3.0 组与对照差异显著(P ＜0.05)。

表1 酸雨胁迫下不同处理组菲白竹各项生理指标的变化

3.4 模拟酸雨胁迫对菲白竹细胞膜透性的影响

细胞膜是细胞与环境发生物质交换的主要通道。在一定因子胁迫下，膜透性的增大、电解质的大量泄漏是膜伤害或变性的重要标志。因此，质膜透性常用以表征植物在逆境胁迫下的伤害程度［18］。从表1可以看出，菲白竹幼苗叶片的质膜透性在植株遭受酸雨胁迫时呈上升趋势，且这种趋势会随着pH 值的降低而愈发显著。恢复初期，pH=4.0 酸雨处理组的质膜透性与对照相比增加了4.79%，而经过13d 解除胁迫的恢复期后，比对照增加7.98%，但到了恢复后期，pH =4.0 酸雨处理的质膜透性已经基本恢复到对照水平。相比而言，pH=3.0、pH=2.0 酸雨处理时，叶片质膜透性在各个时期均显著高于对照，尤其以pH =2.0 处理最为明显，在经过一个月的恢复期后仍然比对照高出34.21%。进一步统计分析表明，在解除胁迫一个月内，pH =2.0、pH=3.0 组与对照组差异均达到显著水平(P ＜0.05)。pH=4.0 组在经过一个月的恢复期后与对照差异不显著(P ＞0.05)。

3.5 模拟酸雨胁迫对菲白竹丙二醛质量摩尔浓度的影响

丙二醛(MDA)是植物遭受逆境伤害时膜脂过氧化的产物［19－20］，可使蛋白质和核酸变性，导致膜流动性降低，膜透性增强，细胞功能下降，严重时导致细胞死亡。由表1可知，在人工模拟酸雨胁迫下，各处理组菲白竹幼苗叶片的MDA 质量摩尔浓度均高于对照，且上升幅度在pH≤3.0 的酸雨处理下最为明显。解除胁迫初期，pH =4.0 酸雨处理组比对照组增加了9.71%，而pH =3.0、pH =2.0 处理组MDA 质量摩尔浓度大幅上升，分别达到了对照组的142.84%、154.48%。10月5日，各处理组与对照相比有明显的回落，但是pH=3.0、pH=2.0 组仍比对照高出17.62%、29.27%。经历了1 个月左右的恢复期后，pH=4.0 处理组MDA 质量摩尔浓度基本恢复至对照水平，而pH=3.0 和pH=2.0 处理组也进一步小幅降低，分别为对照的116.61%、120.89%。多重对比分析表明，9月24日，各处理组MDA 质量摩尔浓度与对照组差异均达到显著水平(P ＜0.05)。而10月26日，pH =4.0 组与对照差异不显著(P ＞0.05)，pH =3.0、pH =2.0 组与对照组差异仍显著(P ＜0.05)。但pH =3.0 和pH =2.0 处理组之间差异不显著(P ＞0.05)。

3.6 模拟酸雨胁迫对菲白竹叶片SOD 活性的影响

SOD 是植物体内清除活性氧系统的第一道防线，是生物体内唯一以自由基为底物的抗氧化酶，可通过歧化反应使超氧自由基生成H2O2和O2，从而阻止危害性很大的超氧阴离子自由基大量生成［21］。由表1可知，随着恢复期的不断延长，遭受不同强度酸雨胁迫的菲白竹叶片SOD 活性变化差异显著。9月24日，由于刚刚经历胁迫处理不久，各处理组叶片SOD 活性均高于对照，且处理组pH 值越低，叶片SOD 活性越高。其中pH =3.0、pH =2.0 处理组叶片SOD 活性上升明显，分别比对照高出10.70%、12.25%。到了10月5日，各处理组叶片SOD 活性迅速下降，并低于对照，且处理组pH 值越低，下降幅度越大。pH =4.0、pH =3.0、pH=2.0 处理组叶片SOD 活性分别为对照的93.07%、90.73%、87.49%。经过1 个月的恢复期后，pH=4.0 处理组较对照又有小幅回升，达到对照的96.32%，基本恢复对照水平。而pH=3.0、pH=2.0 组叶片SOD 活性与对照相比仍有小幅降低的趋势，分别为对照的87.73%、84.05%。方差分析表明，pH=4.0 组经过1 个月的恢复期后，与对照差异不显著(P ＞0.05)。而pH =3.0、pH =2.0 组与对照相比差异显著(P ＜0.05)。

3.7 模拟酸雨胁迫对菲白竹叶片POD 活性的影响

POD 代表了细胞中一类H2O2降解酶，参与植物细胞木质素合成，吲哚乙酸降解以及植物对生物和非生物的胁迫反应。POD 活性上升一方面表明其清除H2O2的能力增强，另一方面提示细胞遭受氧化损伤的程度加剧［22］。由表1可以看出，菲白竹叶片POD 活性在植株遭受高频度酸雨胁迫时，随着胁迫强度的增强呈现不断上升的趋势。9月24日，pH=4.0、pH=3.0、pH=2.0 处理组叶片POD 活性分别比对照高出20.85%、23.70%、28.44%。经过13d 的恢复期后，各处理组较对照显著提高。到10月26日时，pH=4.0、pH=3.0、pH=2.0 处理组叶片POD 活性仍分别比对照高出24.15%、25.60%、37.68%。多重对比分析表明，恢复初期，各处理组与对照差异均达到显著水平(P ＜0.05)，但各处理组之间差异不显著(P ＞0.05)。到了10月26日，pH =4.0、pH =3.0 组之间差异不显著(P ＞0.05)，而与pH=2.0 组之间差异显著(P ＜0.05)。

4 结论与讨论

通过生理指标的测定表明，高频度的酸雨处理后，菲白竹叶片可溶性蛋白质量分数和叶绿素相对含量大幅下降，各处理组之间以及与对照之间均达到显著水平;MDA 质量摩尔浓度和质膜透性则较对照显著升高，上升幅度随酸度的增加而增大。这说明酸雨胁迫下，不同处理的菲白竹叶片均受到不同程度的生理伤害，且伤害程度随胁迫强度的增加而加大。经过1 个月左右的恢复，与对照相比，pH=4.0 处理组上述各项指标均有明显的恢复，接近与达到对照水平(与对照无显著差异)，表明菲白竹对pH=4.0 酸雨胁迫有较强的抵抗和修复能力;pH=3.0 处理组有一定的恢复趋势，但恢复程度不明显(上述各指标仍与对照差异显著)，可能菲白竹缓解pH=3.0 酸雨处理的伤害作用需要经历较长的恢复期;而pH =2.0 处理组叶绿素相对含量、可溶性蛋白质量分数以及细胞质膜透性与对照差异均有所增大，表明pH =2.0 处理组叶片受到了不可逆的生理伤害。上述生理指标的变化结果与形态观察结果一致，说明叶绿素相对含量、可溶性蛋白质量分数、质膜透性等可作为反映酸雨胁迫下菲白竹受伤害程度的重要依据。相关研究表明［23］，酸雨对许多植物叶产生伤害的临界点为pH =3.5，对森林的直接危害仅在降水酸度很高(pH≤4.0)时才会出现。综合本试验的各项指标分析可认为，pH =3.0是本试验条件下酸雨对菲白竹伤害的临界点(或阈值)。不过，本研究采用高频度酸雨处理，比一般研究的低频度酸雨处理对植物的伤害作用更大。因此，菲白竹与一般植物相比具有较强的抗酸胁迫能力，适合作为酸雨地区生态园林工程应用的植物材料。

已有研究表明，酸雨对植物的伤害与活性氧代谢平衡失调有关［24］。正常条件下，植物体内活性氧的产生是有限的，且很快会被保护酶系统所清除，达到一种动态平衡;但在酸胁迫下，这种平衡会被破坏，导致活性氧生产能力大于清除能力，引发活性氧过量积累，引起细胞膜脂过氧化，使细胞受到伤害，生物膜透性增加，最终影响植物的生长发育［25－26］。也有研究认为，酸雨处理后，过多H+进入细胞质，短时间即可直接导致细胞体解以及细胞的亚显微结构被破坏［27］，当过多的H+对某一器官或组织产生直接伤害后，还会由受到直接伤害的器官或组织诱发其他器官产生间接伤害［28］，并通过伤害症状迅速表现在叶片外观形态上［29］。本试验中，菲白竹叶片MDA 质量摩尔浓度随酸雨pH 值的下降显著升高，并且与质膜透性的变化趋势一致，说明酸雨胁迫加剧了菲白竹幼苗的膜脂过氧化作用，导致细胞质膜受损，膜透性增大，进而引发一系列生理和外观伤害。活性氧累积、膜脂过氧化加剧是导致酸胁迫下菲白竹生理伤害的原因之一，而恢复初期菲白竹叶片SOD、POD 活性的迅速上升则是活性氧增多刺激抗氧化系统的结果。经过1 个月的恢复后，各处理组MDA 质量摩尔浓度均大幅下降，表明菲白竹体内抗氧化系统的启动对活性氧的清除能力较强，体现出菲白竹在高频度酸雨胁迫下对植株氧化损伤较强的修复能力，尤其是pH =4.0 处理组各项指标基本恢复至对照水平，且叶片表面无明显的伤害症状。而pH =2.0 处理组在恢复期内与对照相比尽管MDA 质量摩尔浓度降幅显著，但质膜透性、叶绿素相对含量、可溶性蛋白质量分数不仅没有明显恢复，与对照差距还进一步增大，伤害症状也进一步加重，并且出现少量叶片脱落现象，呈现出不可逆的伤害趋势，这说明高频度高强度酸雨胁迫下菲白竹叶片伤害的主要原因可能由过量H+进入细胞对植株造成不可逆的直接伤害引起，活性氧累积所产生的氧化胁迫伤害只是间接的次要原因，因此，植株不能仅仅通过调节抗氧化能力进行伤害修复。此外，过量的H+也可以通过直接致死叶片细胞或由高浓度H+及活性氧引发细胞的程序性死亡［30－32］，使叶片伤斑面积加大，程度加深，并出现坏死斑，导致叶片在恢复期内伤害加重。至于pH =4.0 处理组，可能是H+累积较少，对植株的直接伤害较轻，生理伤害可能主要由氧化胁迫引起，因而可通过调节抗氧化系统进行修复。有关机制尚需进一步探讨。

目前，有关高频度酸雨处理的研究国内外尚少，本研究初步表明，高频度酸雨处理短时间内对菲白竹叶片产生明显的生理伤害，但菲白竹能通过自身代谢调节，适应pH≥3.0 酸雨胁迫，表现出较强的自我修复能力。竹类植物具有繁殖快，固土能力和适应性强等特点，菲白竹作为具有优良观赏价值的竹种，研究结果可为其在酸雨地区引种栽培提供依据，同时也为竹类植物的生态园林工程应用提供参考。

［1］ 杨昂，孙波，赵其国.中国酸雨的分布、成因及其对土壤环境的影响［J］.土壤，1999(1):14 －19.

［2］ Smith W H.Air pollution and forests-Interactions between air contaminants and forest eco systems［M］.New York:Springer-Verla，1981:178 －191.

［3］ 赵德山，王明星.烟煤型城市污染大气气溶胶［M］.北京:中国环境科学出版社，1988:96 －147.

［4］ 吴丹，王式功，尚可政.中国酸雨研究综述［J］.干旱气象，2006，24(2):70 －77.

［5］ 王文兴，许鹏举.中国大气降水化学研究进展［J］.化学进展，2009，21(2/3):266 －281.

［6］ 蒋名淑，施丹平，陈彦.近5a 江苏省苏南五市酸雨分布特征分析［J］.气象科学，2011，31(S1):102 －107.

［7］ 范元中.江苏省酸雨污染二十五年趋势分析及对策［J］.科技创新导报，2011(36):114.

［8］ 谢寅峰，杨万红，杨阳，等.外源一氧化氮对模拟酸雨胁迫下箬竹(Indocalamus barbatus)光合特性的影响［J］.生态学报，2007，27(12):5193 －5201.

［9］ 林树燕，丁雨龙.三种观赏竹抗旱生理指标的研究及其综合评价［J］.竹子研究汇刊，2006，25(2):7 －9.

［10］ 李瑞昌，曹帮华.盐碱胁迫对两种地被竹生长指标的影响［J］.北方园艺，2011(13):83 －87.

［11］ 王文哲，梁青，丁振.日照地区部分竹子的抗寒性研究［J］.山东林业科技，2012(5):22 －25.

［12］ 张春霞，王福升，黄月英.菲白竹组培繁殖技术研究［J］.林业科技开发，2006，20(5):31 －33.

［13］ 李合生.植物生理生化实验原理和技术［M］.北京:高等教育出版社，2000.

［14］ 张志安，张美善，蔚荣海.植物生理学实验指导［M］.北京:中国农业科学技术出版社，2004.

［15］ 徐国伟，吴长付，刘辉，等.麦秸还田及氮肥管理技术对水稻产量的影响［J］.作物学报，2007，33(2):284 －291.

［16］ 王学奎.植物生理生化实验原理和技术［M］.北京:高等教育出版社，2006.

［17］ 谭常，杨惠东，余叔文.植物生理学实验手册［M］.上海:上海科学技术出版社，1985.

［18］ 王应军，邓仕槐，姜静，等.酸雨对木芙蓉幼苗光合作用及抗氧化酶活性的影响［J］.核农学报，2011，25(3):588 －593.

［19］ 彭礼琼，金则新，王强.模拟酸雨对濒危物种夏蜡梅幼苗生理生态特性的影响［J］.植物研究，2013，33(2):202 －207.

［20］ Hodges D M，Delong J M，Forney C F，et al.Improving the thiobarbituric acid－reactive－substances assay for estimating lipid peroxidation in plant tissues containing anthocyanin and other interfering compounds［J］.Planta，1999，207(4):604 －611.

［21］ Gulen H，Eris A.Effect of heat stress on peroxidase activity and total protein content in strawberry plants［J］.Plant Science，2004，166(3):739 －744.

［22］ 王海华，彭喜旭，严明理，等.模拟酸雨和镍复合污染红壤中莴笋的生长与抗氧化反应［J］.水土保持学报，2007，21(3):99 －102.

［23］ 齐泽民，王玄德，宋光煜.酸雨对植物影响的研究进展［J］.世界科技研究与发展，2004，26(2):36 －41.

［24］ 胡晓梅，尚鹤，苟姝贞，等.模拟酸雨胁迫对银杏部分生理特性的影响［J］.河南农业科学，2010(9):106 －109.

［25］ 李志国，翁忙玲，姜武，等.模拟酸雨对乐东拟单性木兰幼苗部分生理指标的影响［J］.生态学杂志，2007，26(1):31 －34.

［26］ 夏钦，何丙辉，刘玉民，等.模拟酸雨对粉带扦插苗形态与生理特征的影响［J］.西南大学学报:自然科学版，2010，32(2):100 －103.

［27］ Gabara B，Sklodowska M，Wyrwicka A，et al.Changes in the ultrastructure of chloroplasts and mitochondria and antioxidant enzyme activity in Lycopersicon esculentum Mill.leaves sprayed with acid rain［J］.Plant Science，2003，164(4):507 －516.

［28］ 倪寿清，宋晓东，崔清洁，等.模拟酸雨胁迫下中国北方小麦生理特性研究［J］.山东农业大学学报:自然科学版，2008，39(1):19 －22.

［29］ 吴中军，李君可.模拟酸雨胁迫对橡胶榕生理生化特征的影响［J］.东北林业大学学报，2011，39(3):26 －27.

［30］ Gill S S，Tuteja N.Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants［J］.Plant Physiology and Biochemistry，2010，48(12):909 －930.

［31］ Cascio V，Gittings D，Merloni K，et al.S-Adenosyl-L-Methionine protects the probiotic yeast，Saccharomyces boulardii，from acid-induced cell death［J］.BMC Microbiology，2013，13:35.

［32］ Wyrwicka A，Sklodowska M.Influence of repeated acid rain treatment on antioxidative enzyme activities and on lipid peroxidation in cucumber leaves［J］.Environmental and Experimental Botany，2006，56(2):198 －204.