免疫相关的巨噬细胞和髓样血管生成细胞在视网膜新生血管发生发展中的作用△

高翔 王雨生

视网膜新生血管(retinal neovascularization，RNV)是许多致盲性眼病共有的病理学特征，如早产儿视网膜病变、糖尿病视网膜病变和视网膜中央静脉阻塞等。RNV的发病机制与内层视网膜血管内皮细胞死亡、毛细血管阻塞引起的缺血、缺氧密切相关。缺血、缺氧可刺激视网膜细胞高表达促血管形成细胞因子，活化血管内皮细胞，使其从原有血管中增生、移行而形成新的血管网，这一过程即血管生成［1-2］。但新生血管是由异常细胞成分构成的，不易建立健康的血-视网膜屏障，易渗漏或破裂，导致视网膜水肿、出血和渗出。RNV存在于视网膜表层，可向玻璃体延伸生长，不断发展必将威胁患者的视功能，因此深入探究RNV发病机制十分必要。近年来研究提示，免疫相关巨噬细胞(macrophages，MΦ)和髓样血管生成细胞(myeloid angiogenic cells，MACs)在RNV发生发展中发挥着重要作用。

1 MΦ在RNV发生发展中的作用

MΦ是固有免疫和获得性免疫反应的关键调节者，在炎症反应中发挥重要作用，是宿主防御的第一道防线。除了这些众所周知的功能外，MΦ在维持机体内稳态方面也发挥着重要作用，其可参与组织创伤修复、组织重建、血管形成和凋亡等［3］。

在氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy，OIR)模型中发现，RNV的形成需要血液-骨髓中的MΦ参与［4-5］。研究观察到，小鼠OIR模型中玻璃体和视网膜MΦ数目显著增加［6-7］。采用免疫荧光法证实，小鼠OIR模型中的 MΦ和小胶质细胞定位在视网膜前的新生血管簇中［4，8-10］，且 F4/80(+)MΦ数目在生后17 d(P17)到P21(即RNV数目最多)时达到高峰［4］。相反，巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)是单核系细胞向成熟MΦ分化所需要的重要细胞因子。当缺乏M-CSF时，OIR中 RNV减少［7］。这些结果表明，活化的MΦ向视网膜募集参与了病理性RNV发生。然而，详细机制还尚未明确。

1.1 MΦ的来源 一般认为，MΦ源于造血干细胞。造血干细胞在骨髓微环境中可分化为髓样祖细胞和淋巴样祖细胞。前者进一步分化为单核细胞，同样也是粒细胞、红细胞、血小板、树突细胞和肥大细胞的共同前体细胞。分化而来的单核细胞随后从骨髓中释放入血液循环。血液中的单核细胞部分可移行到组织中成为定居的MΦ，后者根据其所定居的组织微环境获得特异性免疫表型，具有不同的形态和功能特征，如骨组织中的破骨细胞、肝脏中的Kupffer细胞、肺脏中的肺泡巨噬细胞等［11］。在中枢神经系统中定居的MΦ即为小胶质细胞。关于小胶质细胞的来源说法不一，起初认为源于骨髓，最新研究表明其来源于早期发育过程中出现的胚胎卵黄囊中的祖细胞。这些祖细胞会发育成大脑，并产生小胶质细胞，维持到成年［12］。

参与RNV的MΦ多是从血液中募集而来的。在OIR模型中的RNV达到峰值时，并未观察到视网膜局部小胶质细胞的增殖，表明随RNV出现而增多的F4/80(+)细胞是由血液中单核细胞/MΦ向视网膜组织浸润而形成的［4］。

1.2 MΦ的募集 循环中的单核细胞/MΦ向RNV处募集并促进其形成的具体机制还尚不清楚，可能与多种因子密切相关。

1.2.1 单核细胞趋化蛋白-1 Davies等［4］观察到，在小鼠OIR模型中，当P17～21的RNV达到峰值时，F4/80(+)MΦ数目也达到高峰，同时可见P17时单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoat-tractant protein-1，MCP-1)显著增加。使用 MCP-1缺失(MCP-1-/-)小鼠建立OIR模型观察到，与野生型对照相比，P17时RNV簇相关的F4/80(+)细胞数目明显减少，视网膜 F4/80 mRNA表达明显下降［13］。提示MCP-1可以趋化MΦ参与RNV形成。

1.2.2 基质金属蛋白酶-12 基质金属蛋白酶-12(matrix metalloproteinase-12，MMP-12)可以募集 MΦ参与血管形成。MMP-12亦称巨噬细胞金属弹性蛋白酶，是一种由炎性MΦ表达和分泌的弹性蛋白酶。在一项关于吸烟诱导肺气肿的研究中使用MMP-12缺陷小鼠发现，向肺脏浸润的 MΦ数目明显减少［14］。在关于皮肤肉芽肿和炎性关节炎的研究中表明，MMP-12过表达与MΦ移行增多有关［15-17］。说明在炎症反应中，MMP-12对MΦ的移行和募集发挥重要作用。

有研究表明，在小鼠OIR模型中MMP-12表达上升，伴随着MΦ浸润增加和炎性标志物水平增加。用MMP-12基因敲除小鼠构建OIR模型，视网膜毛细血管阻塞减轻、病理性RNV减少，同时视网膜MΦ数目也减少、MΦ移行能力受损，伴随着黏附分子和炎性细胞因子水平下降、血管渗漏减少。使用MMP-12的药物拮抗剂 MMP408时，也观察到相似的结果［18］。这些结果表明，MMP-12是MΦ向视网膜浸润和炎症反应的关键调节因子，其在视网膜RNV形成中发挥重要作用。

1.3 不同的MΦ极化亚型对RNV的影响 募集到视网膜的MΦ可发挥非常广泛的生物学作用，包括参与RNV形成［19］。MΦ依靠其极化发挥促血管形成和抗血管形成的双重功能，而极化受其定居组织微环境所产生的细胞因子调节［20-23］。在干扰素γ(interferon gamma，IFN-γ)、脂多糖或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子刺激下，MΦ可产生高水平的IL-12、IL-23、IL-6和 TNF-α，低水平的 IL-10。这种“经典活化”的MΦ即M1型MΦ，表现出抗血管形成表型，并在抗菌和促炎方面发挥重要作用。另一方面，MΦ在IL-10、IL-4或IL-13刺激下，可产生高水平的IL-10和低水平的促炎细胞因子，如IL-6和TNF-α。这种“替代活化”的MΦ即M2型MΦ，具有促血管形成功能。根据极化后的功能，可将MΦ进一步分为不同功能的细胞亚型，即负责宿主防御的M1型、负责损失愈合的M2a型、负责免疫调节的M2b型以及负责组织重建调节的M2c型MΦ［24］。

尽管M1和M2型极化代表了两个极端，但MΦ可被活化成为这两种极端之间的任何一种表型。有研究证实，MΦ在这些活化状态之中是具有弹性的，可从一种活化状态快速转变为另一种活化状态，且在具有相反作用的细胞因子刺激下，其活化状态的转变是完全可逆的［25-26］。

近来Marchetti等［27］将体外培养的M1和M2型MΦ，于小鼠P7时经玻璃体进行注射，之后构建OIR模型，于P17时行视网膜铺片、Lectin染色观察，结果表明M1型MΦ可使无血管区面积减少约75%，而不影响RNV区面积;而M2型MΦ则不仅可以使无血管区面积减少约96%，且可同时抑制RNV区面积，使其减少约59%。此研究表明，不同极化状态的MΦ对RNV的影响是不同的。如果可以使MΦ都向M2型极化，则可明显减轻小鼠OIR病变，或许是治疗RNV性疾病的新契机。

一是立志“成一家之言”。在年轻的时候，章学诚就立下大志，要对《汉书·艺文志》进行研究，校雠其书，申明微旨，“又取古今载籍，自六艺以降，讫于近代作者之林，为之商榷利病，讨论得失，拟为《文史通义》一书，分内外杂篇，成一家言”[1]。章学诚的“成一家之言”是要对历史文献“商榷利病，讨论得失”，发现规律，提出新的史学观点，研究新的史学理论。章学诚的学术实践也正是这么做的，他在史学领域大胆发挥，“自信发凡起例，多为后世开山。”[2]为千古史学开辟了新的道路。

1.4 IL-10在MΦ极化亚型转化中的作用 IL-10

是在眼部对MΦ极化及其血管形成能力调节方面最有影响的细胞因子之一［20，28］。在小鼠脉络膜新生血管模型中，IL-10可通过阻止MΦ向脉络膜浸润而促进新生血管生成［28］。另一观点认为，随着年龄增长，IL-10在眼部的基因表达上调，导致在衰老组织中脉络膜新生血管增多，其原因是IL-10可将MΦ极化向促血管形成的表型［20］。

Dace等［29］研究证实，敲除 IL-10(IL-10-/-)会抑制小鼠病理性RNV。视网膜铺片-免疫荧光染色结果表明，IL-10并不影响F4/80(+)MΦ向缺血视网膜的浸润，而IL-10将MΦ极化成具有促血管形成功能的表型可能是主要原因。RT-PCR结果表明IL-10-/-视网膜MΦ所产生的NOS2基因表达减少，即IL-10-/-MΦ产生的促血管形成的NO减少;且在体外实验中发现，在缺氧条件下培养的IL-10-/-MΦ可有效抑制人表皮微血管内皮细胞的增殖，减少VEGF基因表达。说明缺氧可通过IL-10通路使MΦ极化向促血管形成的表型。

IL-10可促进MΦ向M2表型极化。一项研究将IL-10与MΦ共培养发现，长期(7 d)用IL-10培养MΦ可有效抑制经典活化的MΦ(M1型)，而使替代活化MΦ(M2型)标志物表达增加［30］。另一项研究也显示外源性IL-10可抑制M1型MΦ表型，可显著减少M1型MΦ特征性的亚硝酸盐和IL-6的产生，并抑制其介导的VEGF的产生，但未减少M2型MΦ分泌 VEGF［31］。

1.5 MΦ对RNV的多重作用 不论定居在视网膜上，还是从远处募集而来，活化的MΦ在RNV发生发展过程中发挥着多重作用［32］。MΦ不仅在RNV形成中起作用，对RNV的退化也有影响。已有研究证实，活化的 MΦ可通过细胞表面 FasL、TNF-α和TNF相关凋亡诱导配体诱导血管内皮细胞凋亡［33-38］。使用 MCP-1 缺失(MCP-1-/-)小鼠建立OIR模型后发现，在P17时血管簇相关的F4/80+MΦ数目显著下降，但视网膜前RNV内皮细胞核数目无明显变化;在P21和P24时，MCP-1-/-小鼠视网膜前 RNV内皮细胞核数目显著增加［13］。说明MCP-1-/-小鼠RNV簇相关MΦ减少，与RNV内皮细胞凋亡减少及RNV退化延迟密切相关，提示MΦ可通过促进血管内皮细胞凋亡而使RNV退化。

2 MACs在视网膜血管形成中的作用

2.1 内皮祖细胞的概念和分型 内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)的定义存在争议［39］，特别是以EPCs为基础的临床研究常常使用错误定义、成分不同的细胞。目前EPCs定义为血液循环中可参与血管形成的细胞。尽管这个定义范围极广泛，包括了多种细胞类型［40-41］，但目前仍沿用此定义。已有证据表明，EPCs可促进缺血组织和肿瘤组织再血管化［42-43］。

2.2 MACs对血管形成的影响 MACs可通过旁分泌方式促进视网膜血管形成。将MACs与视网膜毛细血管来源的微血管内皮细胞共培养后，MACs不直接参与构建微血管网，但通过旁分泌方式释放促血管形成因子，从而可增加血管样结构的形成。在小鼠OIR模型P12时玻璃体注射红色Qdot标记的MACs后，于P15时行视网膜铺片观察到，注射的MACs没有整合到局部血管网结构中，但其可诱导血管形成和视网膜无血管区再灌注，使无血管区面积减少约 67%［48］。

不论是分子表型，还是抗炎、促血管形成等功能特性，MACs都与替代活化的M2型MΦ很相似［49］。有人证实MACs可作为替代活化的M2型MΦ，通过IL-8发挥促血管形成、抗炎和促组织修复的功能。RT-PCR分析表明MACs高表达M2型MΦ标记物(MSR1、MRC1、IL-10、TGFβ2、CD163 等)及促血管形成基因(VEGFβ、CTGF、PDGFβ、MMP-9 等)，同时低表达 M1 型 MΦ 标记物(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12等)。MACs介导的促血管形成作用高度依赖于其所分泌的IL-8，而非VEGF。已证实MACs来源的IL-8可独立于细胞外VEGF而活化VEGFR2［48］。

综上，MACs可作为替代活化的M2型MΦ，通过旁分泌IL-8的方式发挥促视网膜血管形成功能的结论得到证实。

3 小结

RNV发生发展是一个多细胞参与、多因子调控的复杂过程，MΦ和MACs在其中发挥着重要作用。深入探究免疫相关因素在RNV这一病理过程中的作用机制，进而开展靶向治疗的研究，将可能有助于改善RNV相关疾病的治疗现状。

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