贺利恒,李 燕,黄小都,黄 俊,曾 希*
(1.南华大学 肿瘤研究所,湖南 衡阳 421001;2.耒阳市人民医院 消化内科,湖南 耒阳 421800;3.娄底市中心医院,湖南 娄底 417000)
miR-26a在结肠癌组织中的表达及其临床意义
贺利恒1,2,李 燕1,3,黄小都2,黄 俊1,曾 希1*
(1.南华大学 肿瘤研究所,湖南 衡阳 421001;2.耒阳市人民医院 消化内科,湖南 耒阳 421800;3.娄底市中心医院,湖南 娄底 417000)
目的:探讨miR-26a(Homo sapiens miR-26a)在人结肠癌组织中的表达改变情况及其临床意义。方法:运用qRT-PCR检测72例患者结肠癌组织及对应癌旁正常组织中miR-26a的表达情况。结果:qRT-PCR结果显示,miR-26a在结肠癌组织中较癌旁组织表达显著下调,miR-26a的表达随着结肠癌临床分期的演进和浸润的加深而下调,且有淋巴结转移组织的miR-26a表达显著低于无淋巴结转移组织,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:miR-26a在结肠癌组织中下调,且其下调程度与结肠癌临床分期、浸润深度以及淋巴结转移相关。
miR-26a;结肠癌;临床诊断
最新研究表明,miR-26a在乳腺癌组织和细胞中表达显著下调。miR-26a模拟物转染乳腺癌细胞实验发现,miR-26a可明显抑制乳腺癌细胞增殖[1]。但是目前关于miR-26a在结肠癌发生发展中所扮演的角色没有任何报道。本研究采用qRT-PCR技术,首次分析miR-26a在人结肠癌组织中的表达改变情况及其临床意义,为结肠癌发生发展的分子机制提供实验依据,为其防治提供理论基础。
1.1 实验材料
组织标本来源于2010-2013年中南大学湘雅医院及南华大学附属第一医院收治的结肠癌患者,均按照WHO结肠癌组织学分类及分级标准,其中58例为本研究所以前留下来的标本。miProfileTM miRNA qPCR试剂盒(广州复能基因有限公司);Real-time PCR 96孔板及封口膜(美国ABI 公司)。
1.2 miR-26a表达水平检测
RT反应:反应体系为20μL,包括5×RT缓冲液4μL、25mmol/L镁离子3μL、10mmol/L三磷酸脱氧核苷0.75μL、40U/μL RNA酶抑制剂0.25μL、1μmol/L miR-200c特异性RT引物1.2μL、200U/μL莫罗尼鼠白血病病毒RT酶0.2μL、RNA 1μg,无酶水加至20μL。反应条件:16℃下30min,42℃下30min,再在85℃下10min灭活RT酶,产物于-20 ℃下冻存备用。
qRT-PCR反应:反应体系为20μL,包括稀释后的RT产物2μL、2×qRT-PCR缓冲液10μL、5μmol/L miR-200c特异性PCR引物0.4μL、5 U/μL耐热DNA聚合酶0.2μL、灭菌双蒸水7.4μL。反应条件:先于95℃下活化Tag酶3min,然后于95℃下12s、62℃下35s,共40个循环。
1.4 统计学分析
2.1 结肠癌组织中miR-26a表达水平
本研究运用广州复能基因有限公司推出的miProfile miRNA qPCR Primer,以cDNA为模板的qPCR进行实验验证,检测72例结肠癌患者的肿瘤组织及相应癌旁正常组织中的miR-26a表达水平。结果显示,72例结肠癌组织中miR-26a表达水平是相应癌旁正常组织的0.625倍。笔者选取1例癌旁正常组织的miR-26a值为1,然后分析得到72例结肠癌组织中miR-26a的平均表达水平(2-△△CT)为(0.675±0.046),癌旁正常组织中miR-26a的平均表达水平(2-△△CT)为(1.080±0.043),二者比较差异显著,具有统计学意义(P<0.001)。
2.2 miR-26a的表达与结肠癌临床病理参数之间的关系
以miR-26a表达值的中位数为临界值,miR-26a表达值大于等于中位数为高表达,少于中位数为低表达。结果显示,在72例结肠癌组织中有45例低表达,27例高表达。采用软件分析发现,结肠癌组织中miR-26a的表达与患者年龄、性别、大体分型、分化程度等无显著相关性,差异无统计学意义 (P>0.05);然而miR-26a的表达随着结肠癌临床分期的升高而下调(P=0.006),肿瘤浸润超过浆膜的结肠癌组织中miR-26a降低更明显(P=0.045);同时在有淋巴结转移的结肠癌组织中miR-26a的表达显著低于无淋巴结转移组织 (P=0.020),差异均具有统计学意义。
miR-26a存在于两个染色体位点上,miR-26a-1位于3号染色体CTDSPL基因内含子,miR-26a-2位于12号染色体CTDSP2内含子。目前有关miR-26a在肿瘤发生发展中作用的研究报道很少,发表在国际顶级医学杂志《New England Journal of Medicine》上的一篇报道显示[2],miR-26a在肝癌中表达下调,且在非癌肝组织中,女性的表达水平显著高于男性。此外,miR-26a的表达水平与肝癌患者的生存时间及其对干扰素治疗的敏感性相关。Lu等[3]报道,miR-26a在鼻咽癌中表达下调,其能通过靶基因EZH2抑制鼻咽癌细胞生长和致瘤性,以上研究均表明miR-26a是一个抑瘤miRNA。
本研究通过qRT-PCR证实miR-26a在结肠癌组织中表达显著下调,其表达随着结肠癌临床分期的演进和浸润深度的加深而下调,且有淋巴结转移组织的miR-26a表达显著低于无淋巴结转移组织,提示miR-26a的下调可能与结肠癌的临床分期、浸润深度以及淋巴结转移相关,这意味着miR-26a有希望成为早期大肠癌患者预后的标志物。目前已有许多miRNA被当作潜在的预后标志物,miR-320和miR-498表达下降均与TNM分期II型结直肠癌患者预后相关[4]。其他研究表明[5-6],高水平表达的miR-200c、miR-185、miR-215以及低水平表达的miR-133b均与肿瘤预后不良相关。笔者将继续深入研究miR-26a在结肠癌发病中的功能,系统阐明miR-26a参与结肠癌发生发展可能的分子机制,为其防治提供理论依据和实验基础。
[1] GAEDCKE J, GRADE M, CAMPS J, et al. The rectal cancer microRNAome-microRNA expression in rectal cancer and matched normal mucosa[J]. Clin Cancer Res,2012,18(18):4919-4930.
[2] JI J, SHI J, BUDHU A, et al. MicroRNA expression, survival, and response to interferon in liver cancer[J]. N Engl J Med,2009(361):1437-1447.
[3] LU J, HE ML, WANG L, et al. miR-26a inhibits cell growth and tumorigenesis of nasopharyngeal carcinoma through repression of EZH2[J]. Cancer Res,2011(71):225-233.
[4] SCHEPELER T, REINERT JT, OSTENFELD MS, et al. Diagnostic and prognostic microRNAs in stage II colon cancer[J]. Cancer Res,2008(68): 6416-6424.
[5] AKCAKAYA P, EKELUND S, KOLOSENKO I, et al. miR-185 and miR-133b deregulation is associated with overall survival and metastasis in colorectal cancer[J]. Int J Oncol,2011(39):311-318.
[6] TANG H, DENG M, TANG Y, et al. miR-200b and miR-26a as prognostic factors and mediators of gastric cancer cell progression[J].Clin Cancer Res,2013,19(20):5602-5612.
(责任编辑:尹晨茹)
2013-12-24
国家自然科学基金(81101643)
贺利恒(1980-),湖南省耒阳市人民医院主治医师,研究方向为胃癌发病分子机制。
曾希,南华大学肿瘤研究所副教授,硕士生导师,南华大学病理教研室主任,研究方向为胃癌发病分子机制。
R735.3+5
A
1673-2197(2014)09-0006-02