金银花体外抗流感病毒细胞代谢成分研究

郭承军，张会敏

（1.山东省运动康复研究中心，山东济南250102；2.山东省中医药研究院，山东济南250014）

金银花体外抗流感病毒细胞代谢成分研究

郭承军1，张会敏2

（1.山东省运动康复研究中心，山东济南250102；2.山东省中医药研究院，山东济南250014）

目的考察金银花药物成分经正常细胞及感染流感病毒细胞代谢后，金银花主要成分的变化情况。方法应用中药指纹图谱技术，将得到的色谱图导入指纹图谱相似度评价系统进行分析，比较各组间的标准指纹图谱主要特征色谱峰，找出与金银花抗流感作用相关的差异色谱峰。结果以培养基空白组为对照，正常细胞给药组、病毒细胞给药组各主要特征峰的峰面积表现出整体下降趋势。8号峰面积明显下降，2号峰、7号峰与c号峰与培养基空白组及金银花对照药材比较，相对峰面积成倍增加。结论2、7、8、c号峰对应的化合物可能与金银花抗流感病毒活性密切相关。

金银花；抗病毒；细胞代谢

流感病毒具有病毒典型特征：自身无完整的酶系统，无法自我复制，必须借助宿主细胞的酶系统才能完成整个生命周期。具有抗流感病毒作用的药物通过阻断病毒繁殖过程的吸附、穿入、复制、成熟中的某一环节，继而杀灭病毒或抑制病毒复制，从而达到抗病毒的目的［1］。多年来，本课题组一直致力于中药抗流感病毒的体内外的实验研究，本文应用指纹图谱技术，考察金银花药物成分经正常细胞及感染流感病毒细胞代谢后，金银花主要成分的变化情况，为金银花抗流感病毒的物质基础及作用机理的阐明提供依据。

1 实验材料与仪器

1.1 仪器 Agilent1100 LC高效液相色谱仪（美国安捷伦公司，二极管阵列DAD检测器）；Venusil XBP－C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色谱柱；CO2恒温培养箱（美国FOMAS公司）；－80℃冰箱（美国FOMAS公司）；恒温培养箱；倒置显微镜；净化工作台等。

1.2 试剂 乙腈（色谱纯，天津四友生物医学技术有限公司），甲醇（色谱纯，天津四友生物医学技术有限公司），其他所用试剂为分析纯。绿原酸对照品（中国药品生物制品检定所；批号：110753－200413），DMEM细胞培养液（美国Gibco公司产品，含10%新生牛血清），DMEM细胞维持液（美国Gibco公司产品，含2%新生牛血清），pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS），0.25%胰酶。

1.3 实验材料 金银花（产地：山东平邑）；流感病毒甲型（1995.AII：32094），引自中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所毒种室；MDCK（狗肾细胞系，为流感病毒宿主细胞株），引自中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所流感病毒研究室。

2 实验内容及方法

2.1 提取物的制备 金银花提取物由本实验制备，病毒增殖、病毒对细胞的毒力测定、药物细胞毒性试验等试验方法参见本项目组已发表论文［2］。

2.2 MDCK细胞代谢后供试品的制备 将已长成单层MDCK细胞的培养瓶，分成正常细胞给药组、空白组，病毒细胞给药组、空白组，共4组，每组3个。每瓶加入DMEM细胞维持液100mL，病毒细胞给药组、空白组分别加入流感病毒甲型贮备液15 mL，正常细胞给药组、病毒细胞给药组分别加入金银花提取物0.5 mL，混匀，即得。

培养基空白对照组：取3个与上述规格相同但未接种细胞的无菌培养瓶，每瓶加入DMEM细胞维持液100 mL，金银花提取物0.5 mL，混匀，即得。

将各培养瓶置37℃、5%CO2培养箱中培养72 h，取出，倒置显微镜下观察：病毒细胞空白组细胞胀大、胞内容物增多，破碎，出现大面积的空腔，细胞病变率超过90%；正常细胞空白组细胞生长良好、排列整齐，其他各组细胞形态基本保持完好。

取各培养基液、破碎细胞液，分别于搅拌下缓慢加入5倍量的甲醇，冷藏放置4 h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 对照品、对照药材溶液的制备 绿原酸对照品溶液精密称取绿原酸对照品适量，加甲醇制成约40 μg·mL－1的溶液，即得。

金银花对照药材溶液 取金银花对照药材提取物0.5 mL，加甲醇至5 mL，摇匀，冷藏放置4 h，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

2.4 色谱条件及系统适应性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈－0.4%磷酸－水为流动相，按表1进行梯度洗脱；检测波长为238 nm；柱温：30℃；流速：1 mL·min－1。理论板数按绿原酸峰计算应不低于2 000。

表1 梯度洗脱条件

2.5 测定及图谱处理 照高效液相色谱法［《中国药典》2010年版（一部）附录ⅥD］，依法测定。将得到的色谱图导入指纹图谱相似度评价系统进行分析，比较各组间的标准指纹图谱主要特征色谱峰，找出与金银花抗流感作用相关的差异色谱峰。

3 结果

3.1 培养基中金银花代谢成分指纹图谱 同组内不同供试品的药物成分指纹图谱相似均能达到0.9以上。不同组之间的相关成分峰对位匹配如图1。经比较分析剔除正常细胞空白组干扰色谱峰之后，金银花相关成分峰的色谱峰数据如表2。

图1 各组培养基金银花相关成分峰对位匹配图

表2 各组培养基中金银花相关成分峰数据表

续表2：

3.2 细胞内金银花代谢成分指纹图谱 从各组细胞内指纹图谱检测的结果可以看出，金银花指纹图谱所能显示出的化学成分进入细胞的极少。不同组之间细胞内金银花代谢成分指纹图谱匹配，如图2。相关色谱峰数据见表3。

图2 各组细胞内金银花相关成分峰对位匹配图

表3 各组细胞内相关成分峰数据表

4 小结与讨论

4.1 本实验的研究结果表明：正常细胞空白组培养基及细胞内所含成分对金银花指纹图谱分析无明显干扰。以培养基空白组为对照，正常细胞给药组、病毒细胞给药组各主要特征峰的峰面积表现出整体下降趋势。8号峰是金银花药材指纹图谱中的主要的特征峰之一，在空白培养基组中即明显下降，说明其降低与培养基密切相关，虽然正常细胞给药组仍可检出，但病毒细胞给药组未能检出，说明此成分与流感病毒有一定关系；另外9号峰、10号峰在培养基空白组可检出，而正常细胞给药组和病毒细胞给药组未检出，分析9、10号峰对应的成分与细胞代谢有关，而与抗流感病毒活性关系不大；2号峰、7号峰与c号峰与培养基空白组及金银花对照药材比较，相对峰面积成倍增加，这几个化合物可能与金银花抗流感病毒活性密切相关。

4.2 细胞内金银花代谢成分指纹图谱结果显示：1号峰为MDCK细胞自身含有的成分，2号、3号、5号峰分别为金银花指纹图谱中的第3、4（S）、7号共有特征指纹峰，有少量转入细胞内，可发挥细胞内的抗病毒作用，但病毒细胞组未检出此3个化合物峰，却在25 min左右检出一未知峰，是否属于病毒或由病毒感染后的细胞生成的新次生代谢产物，值得进一步研究。

［1］王雪，杨巧丽，史玉柱，等.中药抗流感病毒作用及机制的研究概况［J］.中国医药导报，2012，9（33）：27－29.

［2］石俊英，郭承军.金银花体外抗流感病毒有效部位研究［J］.山东中医药大学学报，2010，34（2）：178－180.

Study on the com ponents of cellmetabolism of Flos Lonicerae anti－influenza virus in vitro

GUO Cheng-jun1，ZHANG Hui-min2
（1.Athlete Rehabilitation Center of Shandong Province，Jinan 250102，China；2.Shandong Academy of TCM，Jinan 250014，China）

ObjectiveTo investigate themain composition changes of Fols lonicerae through themetabolism of normal cells and cells infectedby influenza virus.MethodsApplied with the fingerprint technology，and imported the obtained chromatograms into fingerprint similarity evaluation system component，and analyzed.Compared the main characteristic peaks of the standard fingerprints among groups to find out the different chromatographic peaks related to the effect of Flos lonicerae anti－influenza.ResultsThe blank group as control，themain characteristic peaks area of the normal cells group and cells group infected by virus showed a general downward trend.Compared with blank group and the controlmedicine Flos Lonicerae，No.8 peak area decreased significantly，No.2，No.7 peak and peak c，relative peak area multiplied.ConclusionThe compounds of2，7，8，c peaks correspondingmay be closely related to the anti－influenza virus activity of Flos lonicerae.

Flos lonicerae；Antiviral；Cellmetabolism

R285

：A

2095－5375（2014）07－0376－003

山东省中医药科技发展计划项目（No.2011－162）；山东省自然科学基金项目（No.Y2007C177）

郭承军，男，博士研究生，副主任中药师，研究方向：运动损伤治疗的中药新药，E－mail：guochj28＠126.com

张会敏，女，博士研究生，助理研究员，研究方向：中药化学、中药炮制及中药质量标准，Tel：0531－82949830，E－mail：huiminzhang＠163.com