正交设计法优选穿山龙提取物的提取工艺

刘 斌，王海燕，高文学

（泰安市食品药品检验中心，山东泰安271000）

正交设计法优选穿山龙提取物的提取工艺

刘 斌，王海燕，高文学

（泰安市食品药品检验中心，山东泰安271000）

目的优选穿山龙提取物的提取工艺。方法采用正交试验设计进行条件优选，以总皂苷和薯蓣皂苷的含量作综合评价。结果优选的提取工艺为：穿山龙加入10倍量60%的乙醇，提取3次，每次1 h。结论该工艺简单合理，稳定可行，可作为穿山龙提取物的提取工艺。

穿山龙；总皂苷；薯蓣皂苷；提取工艺；正交试验

穿山龙为薯蓣科植物穿龙薯蓣Dioscorea nipponica Makino的干燥根茎［1］，是泰山四宝之一，性甘、苦，温。具有祛风除湿，舒筋通络，活血止痛，止咳平喘的功效［1］。其总皂苷类成分具有调节免疫，改善心血管的功能，还具有抗肿瘤、抗炎镇痛等多种作用。总皂苷中的薯蓣皂苷可以合成200多种药物，为合成副肾皮质激素以及口服或注射用避孕药的主要原料［2，3］。泰山的穿山龙资源丰富，具有极高的药用价值和广阔的市场开发前景。本试验以总皂苷和薯蓣皂苷的含量作综合评价，采用正交试验方法对其提取工艺进行优化［4～8］，确定最佳工艺参数。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1260 Series高效液相色谱仪（Agilent1200四元泵，VWD检测器），Agilent Chemstation工作站；TU－1901双波束紫外可见分光光度计（北京普析）；十万分之一电子天平（Mettler Toledo XS205）。

1.2 试药 薯蓣皂苷（中国药品生物制品检定所，批号：110717－200501）。乙腈为色谱纯，甲醇、乙醇等其他试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1.1 穿山龙总皂苷的测定 取薯蓣皂苷对照品13.5 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得对照品储备溶液。精密量取对照品储备液5 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。精密吸取对照品溶液2.0 mL，置具塞试管中，水浴挥干溶剂，精密加入高氯酸10 mL，于60℃水浴加热15 min，冰水终止反应，随行试剂做空白，以紫外分光光度计在406 nm波长处测定吸光度。精密吸取对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置具塞试管中，按相同方法处理后，在406 nm波长处测定吸光度，以吸光度Y（A）为纵坐标，浓度X（μg·mL－1）为横坐标，绘制标准曲线。得到回归方程为Y＝0.019 11X－0.045 3，r＝0.999 4，线性范围为5.4～54.0μg·mL－1。

2.1.2 薯蓣皂苷的测定 采用HPLC法，以薯蓣皂苷含量计。采用Zorbax SB－C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色谱柱，乙腈－水（55∶45）为流动相，测定波长203 nm，流速为1.0 mL·min－1，柱温为30℃，进样量为10μL。

2.2 薯蓣皂苷对照品溶液的制备 精密称取薯蓣皂苷对照品15.25 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇制成含薯蓣皂苷305μg·mL－1的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 称取穿山龙饮片50 g，分别按照不同的提取条件回流提取，过滤提取液，滤液减压干燥制成干膏。精密称取干膏1.00 g，置于200 mL容量瓶中，用65%乙醇溶解并定容至刻度。分别取对照品溶液和供试品溶液进样，色谱图见图1和图2。

图1 薯蓣皂苷对照品色谱图 1.薯蓣皂苷

图2 供试品色谱图 1.薯蓣皂苷

2.4 提取溶剂的初选 穿山龙总皂苷一般极性较大，多采用水、乙醇等极性较大的溶剂进行提取，试验以水、50%乙醇、95%乙醇为溶剂，采用回流提取方式，平行试验，以薯蓣皂苷与总皂苷为指标，初选提取溶剂，结果见表1。

表1 提取溶剂的初选考察

结果表明：水和95%乙醇对于本品提取效果较差，50%乙醇对于总皂苷和薯蓣皂苷提取效果较好，因此我们以中浓度乙醇作为研究基础进行提取工艺研究。

2.5 提取工艺参数优选 影响加热回流提取的主要参数包括提取次数、提取溶剂、提取时间、溶剂用量等。我们在预实验的基础上，以薯蓣皂苷、总皂苷为考察因素，采用建立L16（45）正交实验，优选穿山龙提取物的提取工艺参数。正交实验因素水平表见表2。

表2 正交实验因素水平表

2.6 正交试验结果与方差分析 取样品16份，分别按照正交实验设计提取，制备干膏，测定薯蓣皂苷与总皂苷的含量。由本实验研究目的认为，提取物中薯蓣皂苷与总皂苷的含量具有同等的意义，权衡指标系数皆为5，为避免衡量方式引入的误差，采用系数评分，利用下列公式计算综合评分。实验结果及方差分析见表3～4。计算公式如下：

薯蓣皂苷评分＝（薯蓣皂苷含量／最大薯蓣皂苷含量）×5，总皂苷评分＝（总皂苷含量／最大总皂苷含量）×5，综合评分＝薯蓣皂苷＋总皂苷评分。

表3 回流提取L16（45）正交实验结果

查表知：F0.05（3，3）＝9.28，F0.01（3，3）＝29.46。

结果说明：通过方差分析，4个因素中A＞B＞C＞D，其中A、B因素为显著性影响因素。通过极差分析认为：理论最佳工艺为A3B3C3D3，即分别加入10倍量60%的乙醇提取3次，每次1 h，我们以此为基础进行工艺验证。

表4 回流提取方差分析表

2.7 工艺验证 取100 g药材3份，分别按照上述拟定的提取工艺参数提取，减压浓缩成干膏，测定薯蓣皂苷与总皂苷的含量，进行工艺验证。结果见表5。结果表明：工艺稳定，质量可靠。

表5 工艺验证

3 结果与讨论

3.1 试验首次以穿山龙中总皂苷和薯蓣皂苷为指标，对穿山龙提取物的提取工艺进行研究，达到了较好的提取效果，且工艺稳定可行。

3.2 本试验通过正交试验对穿山龙提取物提取工艺的研究，确定提取工艺为：穿山龙饮片，加入10倍量60%的乙醇，提取3次，每次1 h。经验证试验结果表明，在该工艺下，总皂苷和薯蓣皂苷的含量均较高。

3.3 现代中药提取纯化技术发展迅速，通过一定的方法提取纯化，制备中药提取物，可以有效地除去杂质，提高有效成分的纯度。本试验根据穿山龙饮片中总皂苷和薯蓣皂苷的理化性质，优选了穿山龙提取物的提取工艺，本工艺简单合理，稳定可行，为今后穿山龙提取物的纯化和生产应用提供了必要条件。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版（一部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：250.

［2］仇华泉，苏酩，田景振.中药穿山龙治疗风湿病的研究进展［J］.山东医药，2011，51（11）：115－116.

［3］柳全文，田景振，李民.穿山龙的成分、药理及临床应用研究概况［J］.山东中医杂志，1998，17（1）：29－31.

［4］李东翔，李清，关潇滢，等.HPLC法测定穿山龙中伪原薯蓣皂苷、薯蓣皂苷和延龄草苷的含量［J］.药物分析杂志，2012，32（4）：596－598.

［5］秦兰艳，贾凌云，孙启时，等.RP－HPLC法同时测定穿山龙中薯蓣皂苷和纤细皂苷的含量［J］.沈阳药科大学学报，2007，24（10）：627－630.

［6］孙静，肖彭莹.正交试验法优选穿山龙总皂苷提取工艺［J］.陕西中医学院学报，2010，33（4）：98－99.

［7］徐雄良，柯尊洪，张志荣.正交试验法优选穿山龙总皂苷的提取工艺［J］.华西药学杂志，2003，18（2）：95－98.

［8］刘颖，刘树民，刘磊，等.正交设计法优选穿山龙总皂苷的提取工艺［J］.医学信息（中旬版），2010，5（5）：1247－1248.

表2 三氟乙酸测定结果

由上表可以看出，离子色谱法较高效液相色谱法有较高的检测灵敏度。

4 结语

采用离子色谱法，使用碳酸钠与碳酸氢钠缓冲溶液作为淋洗液对盐酸托烷司琼中的三氟乙酸进行检测，该方法操作简单，专属性强，灵敏度高，线性、准确度均能满足定量测试的要求，该方法检测结果准确可靠，可以作为盐酸托烷司琼中三氟乙酸的测试方法。

参考文献：

［1］向红琳，盛习锋，陈军，等.盐酸托烷司琼的合成工艺改进［J］.湖南师范大学学报（医学版），2006，3（4）：29－30.

［2］张在利，曾子敏，刘忠文.三氟乙酸的制备及应用［J］.化工新型材料，2004，32（9）：44－46.

［3］吴燕，米亚娴.离子色谱法及其在药物分析中的应用［J］.天津药学，2011，23（4）：50－53.

［4］杨小明，赵冬梅，杜秋江等.高效液相色谱法测定比伐卢定中三氟乙酸含量［J］.中国生化药物杂志，2010，31（2）：126－127.

［5］曾铮，张剑波，胡建信，等.北京地表水中三氟乙酸的测定［J］.环境科学研究，2004，17（5）：64－67.

［6］张剑波，胡建信，曾铮，等.地表水中微量三氟乙酸的分析方法［J］.分析化学，2005，33（4）：549－552.

［7］孙长伟，孙华，刘晓玲，等.离子色谱－抑制型电导分析药品中三氟乙酸残留［J］.哈尔滨职业技术学院学报，2011，（6）：117－118.

［8］李偲文，张小东，于泓.离子色谱法同时测定离子液体中的三氟乙酸根、氟硼酸根及卤素离子［J］.色谱，2010，28（7）：708－711.

Orthogonal test for optim ization of extracting procedure from Dioscorea nipponica

LIU Bin，WANG Hai-yan，GAOWen-xue
（Taian Center for Food and Drug Control，Taian 271000，China）

ObjectiveTo select the optimalextracting technology for the extraction from Dioscorea nipponica.M ethodsThe procedure was selected with the contents of diosgenin and total saponins from Dioscorea nipponica by orthogonal test design.ResultsThe optimized extract technology was：Dioscorea nipponica was extracted by ten times of the amount of 60%alcohol for three times，each time for1 hour.ConclusionThe extracting technologywas simple and reasonable，stable and feasible，can be used as the extracting procedure for the extraction from Dioscorea nipponica.

Dioscorea nipponica；Total saponins；Diosgenin；Extraction craft；Orthogonal experiment

R284.2

A

2095－5375（2014）11－0637－003

泰安市科技发展计划（No.20123080）

刘斌，男，主管药师，研究方向：药品检验，E－mail：liubin8247＠sina.com

高文学，男，副主任药师，研究方向：药品检验，Tel：0538－8332398，E－mail：gwx366＠163.com