河豚毒素检测技术研究进展

陈 婧，郭 爽

（1.中国环境管理干部学院，河北 秦皇岛 066004；2.辽宁省葫芦岛市绥中县环境保护监测站，辽宁 葫芦岛 125200）

河豚味道鲜美，享有“鱼中之王”的美誉，但是野生河豚的某些器官，如内脏、卵巢、血液、鱼皮、鱼头等含有剧毒的河豚毒素（Tetrodotoxin，简称TTX），这种毒素加热不分解。我国是河豚鱼的产销大国，每年都有误食河豚导致中毒的现象。出于食品安全考虑，我国的河豚市场还没有完成开放。随着生活水平的提高，人们对食品口感的要求也会越来越高，新鲜野生河豚终有一天会走上餐桌。为了保障河豚食用的安全，除了需要将河豚的销售、加工规范化，快速、高效地检验河豚的毒性也尤为重要。笔者介绍了河豚毒素来源、性质用途及毒素的检测。

1 河豚毒素概述

TTX分布广泛，不仅存在于河豚鱼体内，一些两栖动物比如树蛙（Polyp edates sp.）体表也分泌TTX[1，2]，同时发现有些细菌体内也含有TTX。TTX是一种强神经毒素，分子式为C11H17N3O8，为氨基全氢喹唑啉化合物，是通过与钠离子通道受体结合、阻断电位依赖性通道，从而阻滞动作电位，阻碍与之相关的生理活动，主要是神经肌肉的麻痹，因此它们被作为确定钠通道位置的首选化学标记物，是研究钠通道的重要工具[3]。

河豚毒素虽有剧毒，但其强特异性也使其具有较高的医药价值。目前对河豚毒素的药用价值研究还处在初级阶段，有研究显示[4]河豚毒素主要可以用作消炎镇痛药物，效果和吗啡相差不多。另外河豚毒素还具有抗癌、抗衰老等功效，其医用功效还有待进一步开发。

2 河豚毒素检测方法

2.1 生物检测

2.1.1 小鼠生物测定法

小鼠生物测定法是日本官方最早用来检测TTX的方法。它是通过对小鼠进行腹腔注射TTX，通过观察小鼠的死亡时间来计算TTX计量的检测方法。这种方法是目前TTX检测的标准方法，它规定使20 g ddy系小鼠皮下注射0.2mlTTX溶液，10 min死亡的剂量为1个鼠单位（1 MU）。学者也尝试用不同系列的小鼠来做对比测试。如王静[5]等选用昆明系小鼠为受试对象，对不同质量的昆明系小鼠注射不同剂量的TTX，得出注射剂量与小鼠死亡时间的关系，此方法对TTX的最低检测量为0.20μg TTX，对样品的最低检测限为0.56μg/g。小鼠生物测定法测定TTX方法准确、稳定，但是操作繁琐，尤其对小鼠的要求比较高，检测结果容易受小鼠个体差异影响，而且小鼠价格昂贵。由于小鼠的个体差异，不同种小鼠LD50也有差异。

2.1.2 其他生物试验法

其他生物试验法与小鼠生物测定法原理相同，是以小鼠生物试验法为基础构建的，主要是将其他敏感生物作为受试对象，通过注射不同浓度的毒素，观察生物的症状与死亡时间，得到浓度与死亡时间的关系。张伍金[6]等利用红色鸡泡眼金鱼为受试对象，分别注射不同浓度TTX，观察金鱼出现的症状，记录死亡时间。得到其死亡时间与体重、注射剂量之间的关系表及回归方程。金鱼比较生物试验法与小鼠生物测定法原理及测试方法一致，与小鼠生物测定法相比具有操作简便、价格便宜等优点。

2.2 理化检验法

2.2.1 荧光测试法

荧光测试法是较早研发出来的检测河豚毒素的方法，方法原理是将TTX加碱水解生产C9碱，将水解产物在特定波长下进行荧光检测。郑典元[7]等用荧光分光光度法测试TTX的浓度，实验条件为在370 nm激发，激发狭缝为10 nm，在495 nm处出现特征峰。将荧光分光光度法与小鼠测定法进行比较，发现2种方法有较好的相关性，都可以满足河豚毒素检测的需要。

2.2.2 液相色谱法

色谱法是河豚毒素检测常用的理化方法，其中以高效液相色谱法应用最为广泛，后来发展为多项色谱方法联用的检测技术，比如液相色谱法与气相色谱法联用、液相色谱法与质谱法联用等检测方法。谭桂莉[8]等利用高效液相色谱法测定河豚毒素的含量，选择的液相色谱条件为：Zorbax C18色谱柱，流动相为体积比1 000：0.005的庚烷磺酸钠—三氟乙酸，30℃柱温，流速1.0×10-3L/min。结果发现此法在0.1～15.9μg范围内有很好的线性关系。王智[9]等用Quattro Primer XE超高效液相色谱-串联质谱仪测定烤鱼片、鱼干等干制水产加工食品中TTX毒性，结果表明：此方法的线性范围为2～200 ng/ml，加标回收率为71.2%～102%，RSD为5.23%～12.4%。液相色谱检测方法是目前国内外学者普遍采用的方法，这种方法检测的灵敏度较高，但是前处理麻烦，处理时间长，检验设备昂贵，检验费用高，尤其在样品浓度含量低的情况下测试不准确。

2.2.3 气相色谱法

气相色谱法由于其具有较高的分离效率和灵敏度，成为近年来发展较快的领域，同时，它可与多种高选择性检测器联用，比如与柱后衍生液相色谱进行联用，可以用于痕量分析。后来发展的气质联用使色谱的应用范围更为广阔。吴平谷[10]等采用气质联用的方法测定河豚鱼肉、内脏中的河豚毒素，选择的色谱柱为：HP-5MS 5%苯基甲基聚硅氧烷弹性石英毛细管柱，进样口温度300℃。载气为高纯氦气，流速110 ml/min，不分流进样。实验建立的方法准确，灵敏度高，自动化程度强，测定实际样品效果良好。

2.2.4 薄层色谱法

薄层色谱法适合于较高浓度河豚毒素的检测，此方法过程较液相色谱法简单，对实验设备的要求也相对低一些。林乐明[11]等用薄层色谱扫描法测定河豚毒素，发现激发光波长在230 nm时，出现荧光峰值。此方法与其他色谱法相比，样品用量小，操作步骤简单，可以用于多个样品同时分析。

2.3 免疫检测方法

20世纪80年代末，免疫检测方法才逐渐应用于河豚毒素的检测分析，此方法是基于单克隆抗体技术，将小分子连接到大分子载体，如将TTX连接到BSA、KLH上，使其成为完全抗原，并应用其免疫动物。虽然此种方法起步比较晚，但是因为此种方法具有高度的特异性，2000年以来国外进行了大量的研究，2005年这种方法已经逐渐成熟。国内也有不少河豚毒素免疫检测技术的相关报道。免疫方法最早是由Watabe在1989年建立的，此法是将TTX连接到牛血清蛋白上作为免疫抗原制备单克隆抗体。此后，Neagu等[12]使河豚毒素在催化剂作用下与碱性游离氨基进行偶联，然后将此交联物与特异性抗体进行识别，建立了河豚毒素的直接竞争ELISA检测法。国内学者苗小飞等[13]首先研究了河豚毒素单克隆抗体的制备技术及其特性。此后，王健伟[14]等将河豚鱼的组织匀浆样品经过简单的前处理稀释后，采用免疫学方法检测，该法最低检测限为1 ng/ml。宫慧芝[15]等研制出河豚毒素的快速检测试剂盒，此法的最低检出浓度为5 ng/ml。免疫学方法可以免于前处理的麻烦，可直接进行检测，具有省时、成本低等优点。

2.4 传感器方法

毒性传感器方法是近期发展起来的方法，目前对其研究还处于初级阶段。崔建升[16]等利用地衣芽孢杆菌为响应菌株制备毒性传感器，测试其对河豚毒素的响应，结果表明，10～100μg/ml为线性响应范围，此方法与液相色谱法具有很好的相关性。毒性传感器方法快捷迅速，操作简单，对操作人员没有特别的技术要求，同时价格低廉，但是这种方法的稳定性还有待提高，同时方法操作目前还有待规范化。但是基于食品快速检测的需要，使得河豚毒素毒性传感器方法研究越来越重要，越来越迫切。

2.5 各种方法的比较

小鼠测定法是河豚毒素检测的标准方法，理化检测法方法准确，但是对设备要求高，前处理严格；免疫学方法费用较高；传感器方法是新方法，还有待进一步优化。各种检测方法的比较见表1：

表1 河豚毒素检测方法的比较

3 结论与展望

河豚毒素的检测方法包括生物检测法、理化检验法、免疫学方法和传感器方法。通过对各种检测方法的原理及相关学者的研究进展的综述，分析了各种检测方法的优缺点。每种方法都有其检测的要求和特点，在实际测定中要严格按照样品的特点选取检测方法，如果样品比较复杂，可以选择多种方法进行对照。随着对河豚毒素研究的不断深入和检测要求的提高，应该规范化各种检测方法，同时应该寻找更敏感、准确、快捷和低廉的方法。

目前对河豚毒素的检测方法的研究很多，每种方法都有利弊，如何建立河豚毒素检测方法标准应该是下一阶段的重点研究内容。同时为了满足食品检测的需要，需要开发快速简便的方法，这将是河豚毒素检测的发展趋势。

[1]TANU M B，MAHMUD Y，TSU RUDA K，et al.Occurrence of tetrodotox in the sk in of a rhacophoridid frog Polypedates sp.from Bangladesh[J].Tox icon，2001，39（7）：937-941.

[2]PIRESO R，SEBBEN A，SCHWARTZ E F，et al.Occurrence of tetrod-otoxin and its analogues in the Brazillianfrog Brachycepha lus-ephippium（Anura：Brachycepha lidae）[J].Toxicon，2002，40（6）：761-766.

[3]乔红.河豚毒素研究概况[J].卫生毒理学杂志，1997，11（1）：50.

[4]陈永平，张素青，李春青.河鲀毒素起源及毒理研究进展[J].水产科技情报，2011，38（3）：143-148.

[5]王静，杨丽君，李兆杰，等.昆明系小鼠生物法定量测定水产品中河豚毒素[J].分析检验，2011，3（04）：181-183.

[6]张伍金，蒋云升.金鱼比较生物试验法检测河鲀毒素的研究[J].扬州大学烹饪学报，2011（2）：53-56.

[7]郑典元，夏依依，丁占平.河豚毒素生物测定法与荧光光度法的比较研究[J].湖北农业科学，2012，51（7）：1450-1455.

[8]谭桂莉，林国友.河豚毒素的HPLC方法检测[J].企业科技与发展，2011（13）：26-27.

[9]王智，杨洁，张颖，等.超高效液相色谱——串联质谱法快速测定水产加工食品中的河豚毒素[J].中国渔业质量与标准，2013，3（3）：39-43.

[10]吴平谷，赵永信，沈向红，等.河豚鱼中河豚毒素的气相色谱质谱法测定[J].中国卫生检验杂志，2009，19（3）：549-551.

[11]林乐明，敖丽娟，张军.河豚毒素的薄层色谱扫描法测定[J].色谱，1991，9（2）：113-115.

[12]NEAGU D，MICHELIL，PALLESCHIG.Study of a toxin-alkaline phosphatase conjugate for the development of an immunosensor for tetrodotoxin determination[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry，2006，385（6）：1068-1074.

[13]苗小飞，高静波，宋杰军.河豚毒素单克隆抗体的制备及特性[J].第二军医大学学报，1993，14（6）：540-544.

[14]王健伟，罗雪云，计融，等.间接竞争抑制性酶联免疫吸附试验测定豚毒鱼类中河豚毒素的研究[J].卫生研究，1997，26（2）：106-109.

[15]宫慧芝，计融，江涛，等.河豚毒素单抗ELISA检测试剂盒的研制[J].中国公共卫生，2005，21（12）：1423-1424.

[16]崔建升，陈婧，王芳，等.微生物传感器测定河豚毒素研究[J].海洋环境科学，2009，28（6）：726-728.