中红外光谱法快速测定牛奶中非蛋白氮类物质

李巧玲，刘 峰，宋思远，李劭彤，李朝阳，张二琴

（1．河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄 050018；2．河北科技大学理学院，河北石家庄 050018）

中红外光谱法快速测定牛奶中非蛋白氮类物质

李巧玲1，刘 峰1，宋思远1，李劭彤1，李朝阳2，张二琴2

（1．河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄 050018；2．河北科技大学理学院，河北石家庄 050018）

建立了一种用红外光谱法检测牛乳中掺有非蛋白氮类物质的方法。往牛奶中添加不同含量的尿素和三聚氰胺，通过扣除水背景和牛奶背景等不同方法，利用Nicolet 6700傅立叶变换红外光谱仪获取非蛋白氮类物质的光谱，找出掺假物质的特征峰。将不同MATLAB程序分别同掺假物质特征峰的波数和特征峰的吸光度值或峰面积相结合，可以对牛乳中是否掺有非蛋白氮类物质进行定性和定量分析，其判别正确率为95.49%，相对误差在2%以内。该方法快速、简便易行，适用于多种非蛋白类掺假物质的检测。

牛乳，非蛋白氮，掺假，中红外光谱法，检测

牛奶是自然界给予人类最接近于人乳的天然食品之一，有“白色血液”之称[1]。由于牛奶的钙磷比例恰到好处，所以非常有利于其中钙质的吸收，是人体钙的最佳来源之一。然而随着我国乳制品行业的发展，在利益链条的推动下，一些唯利是图的商家不顾消费者安危，为了提高牛乳中蛋白质的含量，经常向牛乳中掺假。“三聚氰胺”和“皮革乳”等事件，对人们的日常生活产生了严重影响，因此，研究一种快速、便捷、适用于多种掺假物质的检测方法具有重要的现实意义。

目前国内外检测蛋白质的方法[2]主要有：凯氏定氮法[3]、分光光度法[3-4]、杜马斯燃烧法[5]、高效液相色谱法[6]、电泳法[7]及近红外光谱法[8-9]等。在这些方法中，凯氏定氮法和杜马斯燃烧法的最大局限在于无法区分样品中的蛋白氮和非蛋白质氮；而其他大多数方法主要是只能有针对性的检测食品中蛋白质的含量，而对于牛乳中添加了哪种掺伪物均不能给出准确的结果。

本研究以牛奶为原料，将得到的测量样本的中红外光谱图通过扣除水背景、纯牛奶背景等处理后，通过Matlab程序结合测量样本的相关数据，以各种含氮化合物的特征吸收峰的位置、吸光度值或峰面积作为判定依据，实现对牛乳中掺伪物的定性和定量测定，探索牛乳中非蛋白氮类物质快速检测的新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛奶 购自超市和市场；尿素 标准品，上海时代生物科技有限公司；硝酸钠 分析纯，天津市博迪化工股份有限公司；三聚氰胺 标准品，河北省食品质量监督检验研究院提供；溴化钾 光谱纯，天津博君科技有限公司。

Nicolet 6700型傅立叶变换红外光谱仪 美国热电尼高力仪器公司；YP-2型压片机 上海山岳科学仪器有限公司；XW-80A型旋涡混合器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；AL204型分析天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；WS70-1型红外线快速干燥箱 杭州蓝天仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准品采集红外光谱前的预处理 将溴化钾烘干，置于红外线快速干燥箱中备用。称取标准品约1mg，溴化钾约150mg，放于玛瑙研钵中进行研磨，将研磨好的粉末进行压片和检测。为避免背景对红外光谱的影响，设置仪器在每次采集样品光谱前先采集一次背景光谱。

1.2.2 溶液的配制 尿素标准溶液的配制：用万分之一的电子天平分别称取不同量的尿素标准物质，加入牛乳中，配制成含尿素浓度分别为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10、15、20、25mg/mL的10种的牛乳溶液。用漩涡混合器振荡10～20min，使尿素标准物质在液态乳中充分溶解、混匀。

三聚氰胺标准溶液的配制：分别配制成含三聚氰胺浓度为0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0mg/mL的8种牛乳溶液，所有操作按尿素标准溶液的配制方法。

1.2.3 红外测定方法和条件 液态样品和固态标品分别采用衰减全反射（ATR）附件和溴化钾压片法分别采集中红外光谱图。按下列条件进行扫描：波数范围：4000~400cm-1；扫描次数：256次；分辨率：8cm-1。

2 结果与分析

2.1 实验用原料牛奶的确定

本实验为了避免不同品牌牛奶之间存在差异，影响实验结果，因而购买了蒙牛全脂纯牛奶和伊利纯牛奶及散装牛奶进行对比实验。实验前，所有牛奶样品均经过混匀处理。实验用ATR附件测量三种牛奶的中红外光谱，每种牛奶扫描五次取平均值。三种牛奶的中红外光谱如图1所示。从图1中可以看出，三种牛奶在中红外光谱图的出峰位置及走势基本相同，但是吸收峰的强度稍有差异。这主要与牛奶的成分及测量背景差异等方面有关。而且通过多次扫描也发现散装牛奶不如品牌牛奶稳定。考虑到实验的稳定性，也避免不同品牌牛奶的差异性，实验选择同一品牌并且是同一批次的牛奶样品，即蒙牛全脂纯牛奶作为实验样品[10]。

图1 不同牛奶的红外光谱图Fig.1 Infrared spectrum of different milk

2.2 牛奶中掺入非蛋白氮物质含量的确定

考虑现实掺假情况，假设掺假牛奶中的含氮物质全由掺假药品提供，掺入牛奶样品的掺伪物的含氮量应以不超过正常牛奶的蛋白质中的含氮量为宜（市售正常牛奶的蛋白质含量在4%以下）。因每种掺假物质的含氮量不同，计算后尿素和三聚氰胺掺入牛奶中的浓度如1.2.2所示。尿素虽含氮量高，添加14mg/mL左右即会超过4%的含氮量，但考虑到实验结果对比分析等方面的需要，为其多设置了几个浓度梯度。三聚氰胺在水中的溶解度为0.33g/100mL所以三聚氰胺掺入牛奶中的最高浓度为3.3mg/mL[10]。

2.3 牛奶中掺入尿素的红外光谱图

将配制好的含尿素浓度分别为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10、15、20mg/mL和25mg/mL的10种的牛乳溶液，采用ATR附件测量样品4000~800cm-1波数的中红外光谱。每个浓度的样品扫描十次，其中五次为扣除水背景，五次为扣除牛奶背景。用样品光谱扣除水背景和牛奶背景光谱，是为了消除仪器漂移的影响，以便于更明显的看出掺杂物质的特征峰。

图2是掺入各浓度尿素的牛奶样品的中红外光谱图，其中图2a是扣除水背景后的中红外光谱图，可以看出与图1牛奶的中红外光谱图吸收峰的大致位置及形状是相同的。由特征峰放大（图2b）明显发现在1628cm-1和1463cm-1附近掺杂样品有不同于纯牛奶红外光谱的特征吸收峰，这与尿素的标准透射中红外光谱图（图2c）的吸收峰位置基本吻合[10]，并且随着尿素浓度的增加，该特征峰的峰高及峰面积都随之增加。

图2d为扣除牛奶背景后得到的中红外光谱图。由图2d可以看出，掺杂尿素的牛奶样品在1626、1597、1468cm-1位置有吸收峰。其中，1626cm-1处的峰是由尿素中酰胺基中C=O的伸缩振动引起的吸收峰，1597cm-1处的峰是由N-H键的伸缩振动引起的吸收峰，1468cm-1处的峰是由C-N键伸缩振动引起的。在扣除水背景光谱中不能显示的吸收峰，在扣除牛奶背景下都有所显示。且都与各物质的标准透射红外光谱图的吸收峰位置吻合，因此这些吸收峰可以作为特征峰，成为判定掺假物质的依据。

2.4 牛奶中掺入三聚氰胺的红外光谱图

将配制好的含三聚氰胺浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0mg/mL的8种牛乳溶液，进行中红外光谱扫描。每个浓度的样品扫描十次，其中五次为扣除水背景，五次为扣除牛奶背景。图3是掺入各浓度三聚氰胺的牛奶样品的中红外光谱图，其中图3a是扣除水背景后的中红外光谱图，图3b为图3a部分区域的放大图，由此图可以看出掺假样品在1630cm-1、1552cm-1以及1461cm-1左右有不同于纯牛奶红外光谱的特征吸收峰，这与三聚氰胺的标准透射中红外光谱图（图3c）的吸收峰位置类似。但是这三个位置的特征峰都不明显，原因可能是由于加入牛奶中的三聚氰胺的浓度较小，红外光谱的灵敏度较低，因此将此部分区域进行放大后与标准图谱进行对照。图3d显示掺杂三聚氰胺的牛奶样品在1623cm-1，1556cm-1以及1463cm-1三个位置有吸收峰[10]。其中，1623cm-1处的吸收峰是由三聚氰胺中N-H键的弯曲振动引起的，1556cm-1和1463cm-1处的吸收峰是由苯环的伸缩振动引起的。

图2 不同尿素含量的牛奶样品的中红外光谱图Fig.2 Infrared spectrum of different content urea in milk

图3 不同三聚氰胺含量的牛奶样品的中红外光谱图Fig.3 Infrared spectrum of different content melamine in milk

以上分析可以说明，扣除背景光谱的方法可以从复杂的光谱中提取有用信息，通过比较光谱的吸收峰位置，可以有效判别牛奶中是否掺杂异物。对于一个未知样品，可以测得其中红外光谱，扣除背景后，将其吸收峰位置与各掺假物质特征峰位置进行比对，可初步判定具体掺入的物质。

2.5 牛奶中掺入的非蛋白氮类物质的快速检测

通过自行编写的MATLAB程序1结合图2和图3的相关数据，以尿素和三聚氰胺的特征吸收峰位置作为判定依据，可实现对牛奶中掺入的尿素和三聚氰胺的定性测定；通过自行编写的MATLAB程序2结合图2和图3的相关数据，以尿素在1626cm-1和1597cm-1处的双头峰，三聚氰胺在1556cm-1处的特征峰的吸光度值或峰面积作为依据，得到尿素和三聚氰胺的浓度与吸光度值或峰面积的拟合曲线，可实现对液态乳中掺入的尿素的定量测定[1]。其中对掺入牛奶中非蛋白氮类物质浓度在2mg/mL及以上的样品的判别正确率达到95.49%，相对误差在2%以内[10]。

3 结论

本实验建立了一种简便、快速、灵敏的鉴别牛奶中非蛋白氮类物质的检测方法。该方法应用中红外光谱技术，以牛奶中非蛋白氮类物质作为研究对象，通过扣除水背景和牛奶背景等不同方法，得到非蛋白氮类物质的特征峰，利用自行编写的MATLAB程序可实现对牛奶中非蛋白氮类物质的定性定量分析，该方法对掺入牛奶中非蛋白氮类物质的样品的判别正确率达到95.49%，相对误差在2%以内。

[1]李巧玲，刘英华，王宏伟，等.一种中红外光谱检测液态乳中含氮化合物的方法：中国，CN201310180738.6[P].2013-8-14. [2]宋思远，李巧玲，刘英华，等.乳及乳制品中蛋白质检测技术的研究进展[J]. 江苏农业科学，2012，40（5）：279-282.

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[10] 宋思远.中红外光谱技术对液态乳中掺入非蛋白氮物质检测的研究[D]. 石家庄：河北科技大学，2013.

Fast determination of nonprotein nitrogen content in milk based on mid-infrared spectroscopy method

LI Qiao-ling1，LIU Feng1，SONG Si-yuan1，LI Shao-tong1，LI Zhao-yang2，ZHANG Er-qin2
（1.College of Bioscience and Bioengineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，China；2.College of Sciences，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，China）

A method for detection of adulteration in milk containing nonprotein nitrogen by infrared spectroscopy was established.Through adulterating different content of urea and melamine into pure milk，the infrared spectral data of the samples were obtained by the Nicolet 6700 FT-IR Spectrometer，followed by water background correction and milk background correction to carry on processing the spectrum data，the characteristic peaks of urea and melamine were obtained.Combining the different MATLAB program with the wavenumber，the absorbance value or the peak area of characteristic peaks，the adulterants in milk could be judged.The method could be used for quantitative and qualitative analysis of adulterants.The correct recognition rate was 95.49%，the relative error was within 2%.This method was fast，simple and suitable for determination of different nonprotein nitrogen.

milk；nonprotein nitrogen；adulteration；mid-infrared spectroscopy；determination

TS252.7

A

1002-0306（2014）22-0073-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.007

2014－02－25

李巧玲（1973-），女，博士，教授，研究方向：食品安全与检测。

国家科技支撑计划（2012BAD29B04-1-1）；河北省科技支撑项目（12220402D）。