氧载体对番茄红素发酵影响

王英燕，张芙蓉，田智斌

（江苏神华药业有限公司，江苏金湖211600）

氧载体对番茄红素发酵影响

王英燕，张芙蓉，田智斌

（江苏神华药业有限公司，江苏金湖211600）

目的研究氧载体对番茄红素发酵的影响。方法在前期预实验的基础上，获得正己烷，正庚烷，正十六烷的最适添加浓度分别为0.2%、0.3%和1%；最适添加时间是发酵初期第0 h。采用Box－Behnken设计对3种氧载体添加量的协同作用进行优化。结果根据最优预测结果，最终得到番茄红素产率为2.53 g·L－1，对应的氧载体添加量分别为正己烷0.30%，正庚烷0.25%，正十六烷0.88%。结论添加适宜比例的氧载体对番茄红素的发酵具有正向促进作用。

氧载体；番茄红素；发酵；Box－Behnken

番茄红素是膳食中的一种天然类胡萝卜素，广泛存在于自然界的植物中，在人体各组织器官中也有较多分布。番茄红素有比其他类胡萝卜素更好的生物活性，并且是防病治病的重要功能因子，已成为目前国际上功能食品成分研究的一个热点，在医药、食品、化妆品等方面都有着良好的应用前景［1，2］。如何提高番茄红素产率是实现工业化生产的关键因素。在以往的研究中，很多学者通过菌种诱变，培养基条件优化，生产工艺条件优化等手段提高番茄红素的产量。其中，如何增加发酵体系的溶氧水平也是一个重要的研究方面。随着发酵过程的进行，微生物开始大量繁殖，对氧气需求量增大，同时菌体的生长伴随着番茄红素的大量合成，黏度的急剧增加严重阻碍了氧气的传递。较低的溶氧水平是限制番茄红素产量提高的一个关键因素。氧载体是一种对微生物无毒、具有较高溶氧能力的有机物，一般具有比水更高的溶氧能力。液态烷烃，正十二烷，全氟化碳等均可作为氧载体。这类有机溶剂与水不相溶，能够把氧较快的传递给发酵液，

从而提高液相中氧的溶解度［3，4］。Liu等［5］的研究表明在发酵体系中添加正十二烷可以提高透明质酸的产量和分子量；Giridhar等［6］发现正十六烷可以提高L－山梨糖的产量；Umesht等［7］通过在培养基中添加液态石蜡和正十二烷提高L－天冬酰胺酶的酶活。

但对添加氧载体提高番茄红素产量的研究数据还很少。本文研究了添加不同氧载体对发酵生产番茄红素的影响，并对氧载体的添加浓度进行了优化，为实现番茄红素大规模工业化生产奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 菌株 三孢布拉氏霉菌ATCC14271（＋），三孢布拉氏霉菌ATCC14272（－），均购自ATCC。

1.2 仪器和设备 恒温培养箱、恒温摇床、30 L全自动发酵罐、超净工作台、高速离心机、干燥箱。

1.3 培养基 种子培养基（g·L－1）：淀粉40，玉米浆40，葡萄糖25，KH2PO40.5，MgSO40.25，VB少许，用稀盐酸调节pH至6.5，在121℃灭菌30 min，备用。

PDA斜面培养基（g·L－1）：土豆提取液1.0 L、葡萄糖20，琼脂20，VB少许，在121℃灭菌30min，备用。

发酵培养基（g·L－1）：淀粉10，淀粉糖化液30，玉米浆40，KH2PO40.5，MgSO40.25，VB少许，用稀盐酸调节pH至6.5。

1.4 培养条件

1.4.1 孢子悬浮液制备 将三孢布拉氏霉菌（＋）、（－）原菌经活化后，分别接种于PDA斜面培养基上，在28℃条件下，培养箱中培养72 h，然后在有氧、有光的环境中，于18℃再继续培养48 h，可得生长良好的三孢布拉氏霉菌（＋）、（－）菌孢子，分别挑取三孢布拉氏霉菌（＋）、（－）的孢子囊接入已灭菌的生理盐水中，并用磁力搅拌器搅拌，制得孢子悬浮液。

1.4.2 发酵培养 将培养良好的三孢布拉氏霉菌（＋）、（－）菌孢子悬浮液在无菌条件下按1∶2的体积比混合制成种子液。在30 L的发酵罐中加入5 L初始发酵培养基，经121℃、30 min灭菌后，在无菌条件下接入种子液，在28℃条件下进行发酵。

1.5 氧载体 正庚烷，正己烷为分析纯；正十二烷，正十六烷为进口分装。

1.6 分析方法 细胞干重（DCW）的测定：将发酵液离心，把湿菌体置80℃烘箱干燥至恒重后称重。

番茄红素含量的测定参考文献［8］。

1.7 试验方法 前期预实验筛选出了可促进番茄红素产量的氧载体分别为正己烷，正庚烷和正十六烷，其最佳添加浓度分别为0.2%、0.3%和1%。在此条件下对发酵过程的不同时期添加氧载体，确定氧载体的最佳添加时间。进而采用Box－Behnken设计对几种氧载体的协同浓度作进一步的优化。其中Box－Behnken采用Design Expert 8.0数据分析软件分析结果。

2 结果与讨论

2.1 氧载体添加时间的选择 考虑到添加剂正己烷和正庚烷在高浓度时对菌体存在一定的抑制作用，因此有必要研究添加时间对番茄红素生物合成的影响。选择添加剂正庚烷、正己烷和正十六烷，测定不同添加时间对番茄红素发酵的影响。选择在发酵的不同时期（0、24、48、72 h）分别添加0.2%正己烷、0.3%正庚烷和1%正十六烷，考察对发酵生产番茄红素的影响。结果如图1所示，上述几种氧载体在发酵48 h加入时，对菌体生长和产物合成都有明显的抑制作用，可能菌体生长在此时处于对数生长期，外源有机溶剂的添加会对该阶段的细胞生长有一定的抑制作用，进而影响到稳定期番茄红素的合成。其余时间点加入氧载体对番茄红素的生物合成影响不大，其中0 h加入氧载体的效果最好。在后续研究中均在发酵初始加入各种氧载体添加剂。

图1 氧载体不同添加时间对番茄红素发酵的影响

2.2 氧载体对番茄红素生物合成的协同作用

2.2.1 氧载体协同作用对番茄红素发酵的影响利用Box－Behnken设计对正庚烷、正己烷和正十六烷三种氧载体协同作用浓度作进一步的优化。各因素及其水平见表1，Box－Behnken设计结果如表2所示。每个因素3个水平，中心点上作3个重复设计。

表1 Box－Behnken试验设计因素与水平

表2 Box－Behnken试验设计与结果

续表2：

以番茄红素产量为响应值，采用Design Expert 8.0软件对表2中的试验数据进行多元回归分析，结果见表3。最小二乘法拟合二次多项式方程，试验因子与响应值得关系可用以下方程表示：

由表3可知，所选模型的不同处理间差异极显著，说明采用该回归方程描述各因子与响应值之间的关系时，其响应变量与自变量之间的二次线性关系显著，即该试验方法可靠；决定系数R2＝94.74%表明相关性较显著；失拟项差异不显著，表明该多项式对试验数据拟合情况较好，试验误差较小；R2

Pred值为79.97%也能较合理地说明校正决定系数RAdj2＝85.28%的变化，仅4.14%的试验数据不能用此模型来解释，信噪比大于4。因此，可以用该方程代替各组试验对试验结果进行分析和预测。

表3 Box－Behnken试验因素方差分析表

保持其中单一因素最优条件，其他两个因素与响应值关系用响应面图和等值线图表示（如图2、图3、图4所示）。根据回归模型预测出番茄红素的最高产量，即添加正己烷0.30%、正庚烷0.25%、正十六烷0.88%时，番茄红素产率为2.53 g·L－1。

图2 正庚烷和正己烷交互效应对番茄红素产量的影响

2.2.2 回归试验模型验证 为证实预测值与真实值之间的拟合程度，进行3次平行验证试验，即在添加正己烷0.30%、正庚烷0.25%、正十六烷0.88%时发酵生产番茄红素，其产量分别为2.42、2.58、2.49 g·L－1，试验值与模型估计值最大相差1.3%，二者非常接近，表明预测值与试验值有较好的拟合性，进一步验证了该模型的可信程度。

3 结论

正己烷、正庚烷及正十六烷都能够明显促进番茄红素的生物合成，在发酵初始分别添加0.2%正己烷、0.3%正庚烷和1%正十六烷，番茄红素产率分别为2.37、2.29和2.25 g·L－1。进一步通过响应面法Box－Behnken试验设计优化了三者的协同浓度，回归模型预测出在添加正己烷0.30%、正庚烷0.25%、正十六烷0.88%时，番茄红素最高产率为2.53 g·L－1，试验值与预测值拟合良好，达到了优化试验设计的目的。该实验具有重要的生产实践及理论指导意义，可为大规模工业化生产番茄红素奠定了一定基础。

图3 正庚烷和正十六烷交互效应对番茄红素产量的影响

图4 正己烷和正十六烷交互效应对番茄红素产量的影响

［1］Rao AV，Agarwal S.Role of lycopene as antioxidant carotenoid in the prevention of chronic diseases：A review［J］.Nutrition Research，1999，19（2）：305－323.

［2］傅喆暾，袁杰，黄雄伟，等.番茄红素的研究概况及应用前景［J］.现代中药研究与实践，2007，21（1）：58－61.

［3］贾士儒，李小明，包志泉，等.氧载体强化传氧的研究Ⅰ［J］.天津轻工业学院学报，1994，9（1）：7－12.

［4］贾士儒，袁玉华，包志泉.氧载体强化传氧的研究Ⅱ［J］.天津轻工业学院学报，1995，10（1）：1－7.

［5］Liu L，Yang H，Zhang D，etal.Enhancementofhyaluronic acid production by batch culture of Streptococcus zooepidemicus with n－dodecane as an oxygen vector［J］.JMicrobiol Biotechnol，2009，19（6）：596－603.

［6］Giridhar R，Srivastava AK.Productivity enhancement in l－sorbose fermentation using oxygen vector［J］.Enzyme Microbial Technol，2000，27：537－541.

［7］Narta U，Rov S，Kanwar SS，et al.Improved production of L－asparaginase by Bacillus brevis cultivated in the presence of oxygen－vectors［J］.Biores Technol，2011，102（2）：2083－2085.

［8］张邦建，王海峰，侯成林.发酵法生产番茄红素工艺的研究［J］.食品工程，2008，4：14－16.

Effect of oxygen－vector on lycopene fermentation

WANG Ying-yan，ZHANG Fu-rong，TIAN Zhi-bin
（Jiangsu Shenhua Pharmaceutical Co.，Ltd.，Jinhu 211600，China）

ObjectiveTo research the effect of oxygen－vector on lycopene fermentation process.M ethods The results of preliminory experiment showed that the optimal concentration of n－hexane，n－heptane，n－hexadecane added to themedium were 0.2%，0.3%and 1%，respectively.And the optimal adding timewas0 h.The Box－Behnkenmethod was used for the optimization of lycopene production by adding oxygen－vectors.ResultsWhen the fermentation was used under the optimal condition，the lycopene concentration reached 2.53 g·L－1，with the optimal concentration of n－hexane，n－heptane，n－hexadecane added to themedium were 0.30%，0.25%and 0.88%，respectively.ConclusionThe appropriate proportion of oxygen－vector had a positive role in lycopene fermentation process.

Oxygen－vector；Lycopene；Fermentation；Box－Behnken

TS202.1

A

2095－5375（2014）04－0196－004

王英燕，女，研究方向：药品与食品研究，E－mail：wyy408＠126.com