醛糖还原酶基因5′端（AC）n多态性与糖尿病肾病、糖尿病周围神经病变的相关性*

雷佩佩刘长山王秀军薛亚梅

醛糖还原酶基因5′端（AC）n多态性与糖尿病肾病、糖尿病周围神经病变的相关性*

雷佩佩①刘长山②王秀军②薛亚梅①

目的：探讨2型糖尿病（DM）醛糖还原酶（AR）基因5′端的（AC）n的多态性与糖尿病肾病（DN）、糖尿病周围神经病变（DPN）易感性的关系。方法：选择本院2型DM患者119例为DM组，根据其同时伴（+）或不伴（-）DN与DPN，将DM组分为四个亚组：DN-/DPN-组、DN-/DPN+组、DN+/DPN-组、DN+/DPN+组；同时选取健康体检者62例为正常对照（CON）组。采用聚合酶链反应（PCR）及尿素/甲酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳银染显色法分析各组AR基因的二核苷酸（AC）n串联重复序列的多态标记，比较各组间等位基因频率和基因型频率。结果：各组中Z-2等位基因频率比较差异有统计学意义（P＜0.05），其中在DN+/DPN+组最高，在DN-/DPN-组最低；Z+2等位基因频率在DN-/DPN-组显著增高，在DN+/DPN+组显著降低，两组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；纯合子Z-2/Z-2基因型频率在DN+/DPN+组显著高于其余各组，而纯合子Z+2/Z+2基因型频率在DN-/DPN-组显著高于其余各组。结论：Z+2等位基因是2型糖尿病患者发生DN及DPN的保护性基因；Z-2等位基因是DN易感基因，而病程和Z-2等位基因可能共同促进了DPN的发生。

2型糖尿病； 醛糖还原酶； 糖尿病肾病； 糖尿病性周围神经病变

糖尿病肾病（DN）及糖尿病周围神经病变（DPN）均为较常见的糖尿病微血管并发症（DMAP），严重影响患者生活质量。目前大量证据表明遗传因素与环境因素同样在DMAP的发生、发展中起重要作用，醛糖还原酶（AR）基因则是目前最受重视的候选基因之一。本研究旨在探讨山东地区2 型DM患者AR基因5′端的（AC）n的多态性与DN、DPN易感性的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 按照1999年WHO诊断标准选择本院2012 年3月-2013年8月住院或门诊2型糖尿病患者119例为2型糖尿病（DM）组。根据其同时伴（+）或不伴（-）DN与DPN，将DM组分为四个亚组：DN-/DPN-组、DN-/DPN+组、DN+/DPN-组、DN+/DPN+组。其中DN诊断标准为6个月内连续3次测定UAER≥20 μg/min，并排除其他疾病所致的尿白蛋白异常和肾功能不全；DPN诊断标准：（1）肢体感觉及运动神经障碍症状：如患肢麻木、针刺或灼热样疼痛、蚁行感或踏棉垫感等；（2）深浅感觉明显减退，跟腱反射减退或消失；（3）肌电图检查提示运动神经传导速度（MNCV）、感觉神经传导速度（SNCV）减慢；（4）排除其他原因所致周围神经病变。以上患者排除糖尿病急性并发症及甲状腺、垂体疾病等其他内分泌疾病。同时选取健康体检者62例为正常对照（CON）组，全部研究对象均来自山东地区人群，彼此间无血缘关系。考虑到随年龄增加致机体老化对周围神经病变的影响，本次研究排除年龄＞65岁的患者，入选的DM患者病程均＞7年。DM各组空腹血糖（FBG）及糖化血红蛋白（HbA1C）均高于CON组；DM各亚组中，DN-/DPN+组及DN+/DPN+组病程均显著高于其余各亚组，其余指标在各组间差异不明显，见表1。

表1 各组一般临床资料

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA提取 取冻存抗凝全血0.5 mL，用solarbio全血基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）提取DNA，-20 ℃保存。

1.2.2 聚合酶链反应（PCR） 引物序列参考文献[1]设计，由上海生工生物工程公司合成。上游引物：Pr1 5′-GAATCTTAACATGCTCTGAACC-3′， 下 游 引 物：Pr2 5′-GCCCAGCCCTATACCTAGT-3′。PCR反应体系共25 μL：10×Buffer2.5 μL，dNTP、TagDNA聚合酶各0.25 μL，Pr1、Pr2各1.0 μL，模板DNA2.0 μL，灭菌三蒸水18 μL。参数如下：94 ℃预变性5min多30 s，94 ℃变性1min多30 s，56.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共33个循环，末次循环后于72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取10 μL的PCR产物与2 μL加样缓冲液混匀后，于120 g/L聚丙烯酰胺凝胶上电泳（100 mV，15 h），保持低温。凝胶用硝酸银染色法显示结果。

1.2.3 DNA测序 选取部分基因型为纯合子的PCR产物送上海生物工程公司进行测序。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行处理，计量资料以（±s）表示，比较采用t检验、方差分析或Q检验，并确认符合Hardy-weinberg平衡，计数资料比较采用 χ2检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 5′端（AC）n双核苷酸多态性检测结果 CON组及DM各组均检测到7种等位基因，将最常见的（AC）24命名为Z，并将（AC）n的重复数n为21、22、23、25、26、27依次命名为Z-6、Z-4、Z-2、Z+2、Z+4、Z+6。PCR产物长度132～144 bp。

表2 各组等位基因频率比较 次（%）

2.2 AR等位基因频率的比较 各组中Z-2等位基因频率比较差异有统计学意义（P＜0.05），其中在DN+/DPN+组最高，DN+/DPN-组次之，在DN-/DPN-组最低；Z+2等位基因频率在DN-/DPN-组显著增高，在DN+/DPN+组显著降低，两组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.3 各组含Z+2等位基因基因型频率分布 Z+2/Z+2基因型频率在DN-/DPN-组显著增高；X/X基因型频率在DN+/ DPN+组显著增高。各组分别含Z+2、Z-2等位基因的基因型频率分布情况见表3。

2.4 各组含Z-2等位基因基因型频率分布 Z-2/Z-2等位基因频率在DN+/DPN+组显著高于其余各组；Y/Y等位基因频率在DN-/DPN-组最高，在DN+/DPN+组最低，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表3 各组含Z+2等位基因基因型频率分布比较 次（%）

表4 各组含Z-2等位基因基因型频率分布比较 次（%）

3 讨论

临床研究表明DMAP的发生不总与血糖水平有关，高糖血症不是DMAP唯一因素。目前多数学者认为，糖代谢的多元醇通路与DMAP有密切关系。AR是多元醇通路的限速酶，广泛存在于神经、视网膜、晶体、肾小球和血管壁等非胰岛素依赖性组织。在生理的血浆葡萄糖浓度下，AR对葡萄糖的亲和力低（Km=70 mmol/L），所以该通路代谢率极低。当某些因素导致AR激活，它对葡萄糖的亲和力明显上升（其Km值减小近10倍），对葡萄糖的转化能力亦增强，使山梨醇在细胞内大量产生，导致细胞膜的结构和功能受损而干扰细胞的正常代谢[1-2]。

本研究结果显示：CON组及DM各组AR5′端（AC）n均存在7种等位基因（Z-6～Z+6）；Z+2等位基因频率在DN-/DPN-组显著增高，在DN+/DPN+组显著降低，两组比较差异有统计学意义（P＜0.01），且Z+2/Z+2基因型频率在DN-/DPN-组显著高于其余各组，提示Z+2等位基因是DN 及DPN的保护性基因；Z-2等位基因频率在各组中有显著差异（P＜0.05），其中在DN+/DPN+组最高，DN+/DPN-组次之，在DN-/DPN-组最低，同时Z-2/Z-2基因型频率在DN+/DPN+组亦显著高于其余各组，提示Z-2等位基因是DN的易感基因；因随机选的DPN+患者病程显著高于其他各组（P＜0.05），推测病程和Z-2等位基因可能共同促进了DPN的发生。这与1997年Heesom等[3]的研究基本一致。Yang等[4]研究显示，Z-2等位基因携带者AR基因转录活性最高，进一步证明Z-2等位基因与DMAP有密切关系。但Park等[5]对韩国2型DM患者的研究中发现AR基因5′端多态性与DMAP易感性无关，Moczulski等[6]对高加索2型DM患者的研究发现，大量蛋白尿、微量蛋白尿及正常蛋白尿患者的Z-2和Z+2等位基因频率并无明显差异。国内外各种研究结果不尽相同，可能与种族、样本数及临床情况等不同有关，还需要多种族大样本的联合研究。

[1] Neamat - Allah M，Feeney S A，Savage D A，et al.Analysis of the association between diabetic nephropathy and polymorphism in the aldose reductase gene in type 1 and type 2 diabetes mellitus [J].Diabet Med，2001，18（11）：906-914.

[2] Radkin P.Risk factors for the development of complications of dia-betic complications[J].J Diabet Complications，1996，8（6）：195-200.

[3] Heesom A E，Hibberd M L，Millward A，et al.Polymorphism in the 5’-end of the aldose reductase gene is strongly associated with the development of diabetic nephropathy in typeⅠ diabetes[J].Diabetes，1997，46（15）：287.

[4] Yang B，Mill Ward A，Demaing A.Functional differences between the susceptibility Z-2/C-106 and protectiveZ+2/T-106 promoter region polymorphisms of the aldose reductase gene may account for the association with diabetic micro vascular complications[J]. BiochimBiophys Acta，2003，1639（1）：1-7.

[5] Park H K，Ahn C W，Lee G T，et al.（AR）n Polymorphism of aldose reduetase gene and diabetic microvasular complications in type 2 diabetes mellitus[J].Diabetes Res Cli Pract，2002，55（2）：151-157.

[6] Moczulski D K，Burak W，Doria A，et al.The role if aldose reductase gene in the susceptibility to diabetic nephropathy type2 （non-insulindependent） diabetes mellitus [J].Diabetologia，1999，4（2）：94-97.

Relationship between the Polymorphism of（AC）n in 5′ End of the Aldose Reductase Gene and the Susceptibility of Diabetic Nephropathy， Diabetic Peripheral Neuropathy

LEI Pei-pei，LIU Chang-shan，WANG Xiu-jun，et al.//Medical Innovation of China，2014，11（03）：018-020

Objective：To study the relationship between the polymorphism of （AC）n in 5′end of the AR gene and the susceptibility of diabetic nephropathy， diabetic peripheral neuropathy in type 2 DM.Method：Chosen our hospital 119 patients with type 2 DM for DM group， at the same time，according to its companion （+） or without （-） DN and DPN， DM group were divided into four subgroups： DN/DPN - group， the DN/DPN + group， DN + / DPN - group， the DN + / DPN + group； At the same time chosen 62 cases of healthy check-up as normal control group （CON）. The polymerase chain reaction （PCR） by urea， formamide and polyacrylamide gel electrophoresis， silver dye chromogenic method AR gene dinucleotide （AC） n polymorphism of tandem repeat sequence tags were used and analyze in each group， compared the allele frequency and genotype frequency of each group.Result：The frequence of Z-2 allele in DN+/DPN+ group was much higher than that in the other groups （P＜0.05）. The frequence of Z+2 allele in group DN+/DPN+ was much lower than that in the other groups （P＜0.01）； Z-2 / Z-2 genotype frequency in the DN+ / DPN+ group was significantly higher than that of the other groups， and Z+2 / Z+2 genotype frequency in the DN- / DPN- group was significantly higher than the other groups.Conclusion：AR gene alleles are associated with the development of diabetic microangiopathy. The Z+2 allele protect against the development and progression of DN and DPN. Whereas，the Z-2 allele may be a risk factor for the developing of DN. Both the course of DM and Z-2 allele promote the development of DNP.

Type 2 diabetes mellitus； Aldose reductase； Diabetic nephropathy； Diabetic peripheral neuropathy

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.03.007

2013-09-07） （本文编辑：蔡元元）

山东省医药卫生科技发展计划项目（548945）

①潍坊医学院 山东 潍坊 261042

②山东省潍坊市人民医院

刘长山

First-author’s address：Weifang Medical School，Weifang 261042，China