白胡椒和黑胡椒配伍清除羟基自由基和超氧阴离子作用研究＊

李 莉 赵启鹏 平顶山学院医学院（平顶山467000）

胡椒（Piper nigrum L．）属胡椒科（Piperacea），多年生常绿藤本植物，原产于印度，是世界重要的热带香辛料作物，在医学工业和食品工业都有广泛用途。成熟的胡椒果晒干后果皮皱缩变黑为黑胡椒，成熟果实脱皮后称为白胡椒。胡椒性热，味辛，有温中散寒、下气、消痰之功效。胡椒含胡椒碱、水芹烯、丁香烯等成分，具有除臭、防腐和抗氧化作用。

《回回药方》成书于元朝中、后期，是一部回族医药典籍，是研究中国回医药学的重要文献之一［1］。《回回药方》中有许多治疗脑卒中的药方，其中大多数药方中均有白胡椒和黑胡椒，且用量相同，本研究旨在采用体外抗氧化方法研究两者之间不同的配比对抗氧化作用的影响。

1 材料与方法 1．1 药品与试剂 白胡椒、黑胡椒（购自海南文昌）；维生素C（批号10090426，西安利君有限责任公司生产）。Tris-HCl缓冲溶液 （50mmol／L，pH 8．2）；PBS粉末（批号：20100817，天津市光复科技发展有限公司生产）；邻二氮菲（批号：20110124，天津市大茂化学试试厂生产）；30%过氧化氢（批号：20100915，国药集团化学试剂有限公司生产）；硫酸亚铁晶体（批号：20110121，天津市光复科技发展有限公司生产）；邻苯三酚（批号：20100425，天津市大茂化学试试厂）；95%乙醇（批号：20090110，天津市科密欧化学试剂有限公司生产）；无水乙醇（批号：20101108，天津市瑞金特化学品有限公司生产）。

1．2 主要仪器 中草药粉碎机（FW177型，天津市泰斯特仪器有限公司）；数显恒温水浴锅（HH-2型，金坛市鸿科仪器厂）；超声波清洗器（KQ-500DA型，昆山市超声仪器有限公司）；台式离心机（TGL-16G型，上海安亭科学仪器厂）；可见紫外分光光度计（岛津UV-2550型）；电子分析天平 （岛津AEU-210型）。

1．3 实验方法 1．3．1邻二氮菲法［2］：邻二氮菲-Fe2＋是常用的氧化还原指示剂，其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原状态的改变。羟自由基是强氧化剂，作为反应物，H2O2／Fe2＋体系可通过Fenton反应产生羟自由基，邻二氮菲-Fe2＋水溶液被羟自由基氧化为邻二氮菲-Fe3＋后，其510nm最大吸收峰消失。当反应体系中存在·OH清除剂时，该氧化过程受到抑制，A510nm则降低不明显，故可通过510nm处A值比较抗氧化剂清除·OH的能力。

在10mL试管中依次加入1．5mmol／L邻二氮菲无水乙醇1．0mL、PH值为7．4的PBS缓冲液2．0mL和蒸馏水1．0mL，充分混匀，加入1．5mmol／LFeSO4溶液1．0mL ，边加入边摇匀，再加入0．015%H2O2溶液1．0mL，置于37℃水浴中反应60min，以体积比为2∶1的缓冲液和双蒸水做参比液，在510nm波长处测其吸光度D1。

按上述操作步骤，用1．0mL 双蒸水代替1．0mL 0．0015%H2O2，在510nm测其吸光度D2；用不同浓度的样品代替1．0mL双蒸水，以体积比为2∶1的缓冲液和双蒸水做参比液，在510nm波长处测其吸光度D3，每次加样品充分摇匀。具体操作步骤见下表一。按下列公式计算清除率。抑制率（%）=100×（D3-D1）／（D2-D1）D3、D1、D2分别为加入加样品、不加样品、不加样品和H2O2体系的吸光度值。

表1 黑、白胡椒清除·OH自由基操作表

1．3．2 邻苯三酚自氧化法［3］：邻苯三酚在弱碱性环境下发生自氧反应生成O2-·，邻苯三酚自氧化产物最大吸收波长为300 nm，而O2-·清除剂能使其产物在300nm处吸收峰受到抑制，随着300nm处A值的变化来比较O2-·清除剂的清除能力。

邻苯三酚自氧化法产生O2-·。取50mmol／L Tris-HCl缓冲溶液 （pH 8．2）4．5mL，立即加入预热的3mmol／L邻苯三酚0．5mL，迅速摇匀后倒入比色皿，以不加邻苯三酚溶液作对照，在300nm下每隔30s测定一次D值，重复三次，取平均值，连续测定min，计算线性范围内邻苯三酚自氧化速率。

按上述步骤在加入邻苯三酚之前，分别加入样品溶液0．1mL，相应减少双蒸水的量，同样以不加入邻苯三酚溶液作对照，在300nm下测吸光度值，一吸光度和时间作图表示邻苯三酚自氧化得抑制情况。具体操作步骤见下表二。根据公式计算抑制率。

D3为邻苯三酚自氧化吸光度值，D4为加入样品液后邻苯三酚自氧化吸光度值。

表2 黑、白胡椒清除O2-·自由基操作表

2 结 果 2．1 乙醇最佳浓度的选取 用65%、80%、95%乙醇提取白胡椒黑胡椒，用紫外分光光度计测定，数据如下。

2．1．1 不同溶剂提取物对羟基自由基清除作用：

表3 黑、白胡椒不同浓度乙醇提取物对羟基自由基清除作用的影响

由表3可知，65%乙醇提取物抑制率羟基自由基较好，并且黑胡椒抑制羟基自由基较好。

2．1．2 不同溶剂提取物对超氧阴离子清除作用：

表4 黑、白胡椒不同浓度乙醇提取物对超氧阴离子清除作用的影响

由表4可知，80%乙醇提取物抑制超氧阴离子较好，并且白胡椒抑制超氧阴离子较好。

2．2 白胡椒和黑胡椒互配对羟基自由基、超氧阴离子的影响

2．2．1 白胡椒和黑胡椒互配对羟基自由基的影响：用65%乙醇提取白胡椒和黑胡椒不同配比提取物，结果表明，白胡椒：黑胡椒为1∶3的比例清除羟基自由基作用最佳。

表5 白胡椒和黑胡椒互配对清除羟基自由基作用的影响

2．2．2 白胡椒和黑胡椒互配对超氧阴离子的影响：用80%乙醇提取白胡椒和黑胡椒不同配比提取物，结果表明，白胡椒：黑胡椒为1∶1的比例清除超氧阴离子的作用最佳。

表6 白胡椒和黑胡椒互配对清除超氧阴离子作用的影响

3 讨 论 本研究参照对陈文学［4］、王颖［5］等人黑胡椒和白胡椒研究。研究表明，黑、白胡椒清除羟基自由基的最佳乙醇提取浓度为65%，而清除超氧阴离子的最佳乙醇提取浓度为80%。这与陈文学［4］等人对白胡椒黑胡椒互配最佳乙醇浓度研究的结果有所不同，他们用油脂抗氧化值的检测方法，最佳乙醇浓度为80%。这说明，方法对最佳乙醇浓度的选取有一定的影响。白胡椒清除超氧阴离子的能力略优于黑胡椒，黑胡椒清除羟基自由基的能力略高于白胡椒。这与王颖［5］等人对黑胡椒和白胡椒精油抗氧化性能及清除自由基能力进行比较研究结果有所差异。他们用水蒸气蒸馏提取黑胡椒和白胡椒精油，研究表明黑胡椒精油在清除羟基自由基和超氧阴离子的能力都强于白胡椒精油。我们用超声波提取法提取黑胡椒和白胡椒，所用的是乙醇提取液，这种不同之处可能导致了研究结果出现的差异。白胡椒∶黑胡椒为1∶1的比例清除超氧阴离子的作用最佳，与《回回药方》中二者等量使用相符；而白胡椒∶黑胡椒为1∶3的比例清除羟基自由基作用最佳。黑、白胡椒等量配伍使用的更深入的机制有待进一步研究。

［1］ 冯彩琴，牛 阳，杨 东，等．《回回药方》防治脑系疾病的剂型及用药规律探析［J］．宁夏医科大学学报，2011，33（2）：103-104．

［2］ Benzie IF，Strain JJ．The ferric reducing ability of plasma（FRAP）as a measure of “antioxidant power”：the FRAP assay［J］．Anal Biochem，1996，239（1）：70-76．

［3］ 赵咏梅，赵银萍，李宝茹．三种中成药抗氧化活性的测定［J］．陕西中医，2011，32（2）：221-223．

［4］ 陈文学，豆海港，仇厚援，等．胡椒抗氧化产物提取条件的研究［J］．热带农业科学，2005，25（2）：1-3．

［5］ 王 颖，姜子涛，李 荣，等．黑胡椒和白胡椒精油抗氧化性能及清除自由基能力的比较［J］．中国调味品，2009，34（5）：50-58．