水貂源绿脓杆菌的分离鉴定及致病性试验

戴秀美，张永兵，惠涌泉，王秋菊，常维山＊

（1.山东农业大学动物科技学院，山东泰安271018；2.山东诸城市皮毛动物研究所，山东诸城262200）

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）又称绿脓杆菌，可引起水貂的急性、以出血性肺炎和败血症为主要特征的感染，该病发病急、死亡快，猝死水貂往往出现口鼻出血［1］，常呈地方性暴发，发病貂当场病死率10%～50%［2］。绿脓杆菌病是严重威胁养貂业的重要细菌病之一，广泛存在于水、土壤、空气、动物的肠道和皮肤，是一种常见的条件致病菌［3］，且属于人畜共患传染病。该病在瑞典、芬兰、美国、日本、法国等国均有报道。近几年来，随着养貂规模的扩大，临床上由绿脓杆菌引起的水貂出血性肺炎日益增多［4］，2001年后该病在我国各省频繁暴发，山东、吉林、黑龙江、河北、内蒙古等省水貂养殖场相继暴发了水貂出血性肺炎［5-8］。

本文通过对2013年8月山东诸城市某水貂养殖户送检的5只病貂进行病理剖检、实验室检查及分子生物学诊断确诊为绿脓杆菌感染。随后对分离细菌进行了药物敏感试验、致病性试验，结果表明本菌对许多抗菌药物均有耐药性，且致病性较强。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 诸城市某水貂养殖场送检的5只病死水貂剖检采集的病料。

1.1.2 实验动物 20只体重为20g～25g的洁净级昆明小鼠，为山东泰邦生物制品有限公司产品。

1.1.3 主要试剂 PCR反应所用试剂（10×PCR buffer、dNTPs、Taq酶）为宝生物工程（大连）有限公司产品；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、细菌DNA提取试剂盒为上海生工生物工程技术服务有限公司产品；DNA标准DL 2 000为北京全式金生物技术有限公司产品；微量生化发酵管和药敏纸片为杭州天河微生物有限公司产品；普通营养琼脂、LB普通液体培养基、绵羊血（50mL/L）琼脂培养基由山东农业大学预防兽医学细胞免疫实验室自行配制。

1.2 方法

1.2.1 流行病学调查 通过问诊及实地考查，了解该水貂场发病情况、临床症状，然后对病死水貂进行剖检，观察主要病理变化。

1.2.2 病料的采集和细菌的分离培养 无菌取5只病死水貂的肺脏、肝脏、脾脏等作为被检病料，4℃保存。从被检病料中分离细菌，划线接种于普通琼脂平板、绵羊血琼脂平板，37℃培养24h后观察。挑取典型菌落进行纯培养并对其进行革兰染色，显微镜下观察细菌形态特征。

1.2.3 生化试验 采用细菌生化鉴定管对纯培养物进行生化鉴定，接种后的发酵管置于37℃恒温培养箱中，培养18h～24h，统计生化试验结果。

1.2.4 16SrRNA基因的PCR扩增 对上述5份病料中分离出的细菌纯培养物接种于普通LB液体培养基中培养24h，分离菌株基因组DNA的提取按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明进行。参照文献［9-10］针对绿脓杆菌16S核糖体DNA序列的特点设计合成了一对引物，上游：5′-GGGGGATCTTCGGACCTCA-3′，下 游 5′-TCCTTAGAGTGCCCACCCG-3′。PCR 反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，dNTPs（2.5mmol/L each）2 μL，DNA1μL，上、下游引物（20μmol/L）各0.5μL，Taq酶（5U/μL）0.5μL，加ddH2O补至25μL。PCR反应条件：94℃2min；94℃20s，58℃30s，72℃40s，25个循环；72℃1min，4℃终止反应。产物胶回收后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将5株分离菌的16SrRNA基因测序结果通过NCBI的Blast检索系统进行检索。

1.2.5 药物敏感性试验 将分离纯化的5株菌接种于普通LB液体培养基进行摇菌，24h后取菌液进行平板涂布，将药敏片平铺于培养基表面，37℃培养24h后测量各种抗菌药物的抑菌环直径。根据文献［11］判定标准进行判定。

1.2.6 半数致死量（LD50）测定 随机选取1株测定对小鼠的LD50，将菌液在37℃摇床摇菌18h后，分别将菌液稀释10-1～10-10倍稀释后采用平板涂布计数法测定菌液细菌数。20只20g～25g的洁净级昆明白小鼠，随机分为5组，每组4只，其中1组～4组分别腹腔注射10-1、10-2、10-3、10-4倍稀释的菌液0.2mL；第5组为对照组，注射等量培养18h的LB液体培养基。攻毒后连续观察3d，采用Karber法计算LD50。

2 结果

2.1 流行病学调查

实地观察及询问发现送检病料养貂场发病水貂从幼龄期到成年期均有发病，且该养殖场每年在7、8月份都会暴发一次出血性肺炎，临床症状多表现为水貂精神沉郁、行动迟缓、呼吸困难、部分鼻孔流出红色泡沫样液体等。对送检的5只死亡水貂剖检病变相似，病变主要在肺部，肺部大面积出血肿大切面流出红色泡沫（图1A）、喉头出血（图1B）、气管、支气管内有泡沫样液体、脾脏肿大并有散在出血（图1C）、肾脏出血、胃（图1D）及小肠黏膜出血等。

图1 死亡水貂肺脏、喉头、脾脏、胃黏膜的剖检变化Fig.1 Pathological lesions of lung，throat，spleen and gastric mucosa in the dead mink

2.2 分离培养结果及细菌形态观察

5株分离菌均在普通琼脂平板上长出圆形、湿润、光滑、稍隆起、边缘整齐的中等大小菌落，整个培养基被染成绿色，且培养基有独特的苹果香味；在绵羊血琼脂培养基上形成溶血环，灰色，不规则。菌体为革兰染色阴性、中等大小的杆菌，单个或呈短链状。初步判定为绿脓杆菌，将5株菌分别命名为LV-ZC1-5。

2.3 生化试验结果

对5株分离菌的纯培养物进行常规生化鉴定，5株菌鉴定结果一致，鉴定结果见表1

表1 分离菌株的生化鉴定结果Table 1 The biochemical test results of the isolated bacterial strains

2.4 16SrRNA目的基因的PCR扩增结果

提取5株分离菌的基因组DNA，对其16SrRNA序列进行扩增，结果显示在约970bp左右处出现目的条带，与预期（956bp）相符（图2）。将LN-ZC-1和LN-ZC-2株进行测序，两株的同源性为100%，与P.aeruginosa XB7（KF447413）菌株同源性为99.7%。证明2个分离菌均属于绿脓杆菌属。

图2 5株分离菌16SrRNA目的基因的PCR扩增结果Fig.2 PCR amplification results of 16SrRNA gene of five isolated bacterial strains

2.5 药敏试验结果

分别测量以上5株分离菌的菌环大小，5株菌的药敏结果相似，结果见表2。

表2 5株分离菌株的药敏试验Table 2 Drug sensitivity test of five isolated bacterial strains

结果表明本分离菌株对环丙沙星、左氧氟沙星等高度敏感，对多黏菌素、强力霉素、头孢噻肟等中度敏感，对替米考星、复方新诺明、甲氧苄啶、土霉素、痢菌净等耐药。

2.6 LD50测定

平板涂布计数测得原菌液数为1.0×1010cfu/mL，LD50采用Karber法计算。公式如下：LD50＝Lg-1［Xm-i×（∑p-0.5）］，Xm 为最大剂量组对数值，i为相邻两组对数剂量的差值，∑p为各组动物死亡率之和。1组～3组死亡率为100%，4组和对照组死亡率为0%。计算可知本菌株对小鼠的半数致死量为3.2×107cfu/mL。

3 讨论

绿脓杆菌在自然界广泛存在［12］，尤其在高温高湿环境中，更利于绿脓杆菌的滋生和繁殖。本文病料为2013年8月份送检的发病水貂，此时正值高温高湿天气，极利于本病的传播。根据病貂临床症状、病理剖检变化初步怀疑为绿脓杆菌感染，结合革兰染色镜检、生化特性和16SrRNA基因测序确定分离菌为绿脓杆菌，随后对分离菌进行了药敏试验，结果表明分离菌株对环丙沙星、左氧氟沙星高度敏感，对多黏菌素、强力霉素、头孢噻肟中度敏感，对替米考星、复方新诺明、甲氧苄啶、土霉素、痢菌净等耐药，可能是由于抗菌药物的使用不规范导致了耐药菌株的产生，因此建议水貂养殖户在疫情发生时，应当根据药敏试验结果选择最适药物进行治疗，避免盲目投药，错过最佳治疗时机。随后测定了分离株对小鼠的半数致死量为3.2×107cfu/mL，结果表明该菌对小鼠致病性很强。近年来，绿脓杆菌引起的出血性肺炎对毛皮动物养殖业的危害日益严重，因此对于防控本病应当引起足够的重视。

16SrRNA为所有细菌共有，是细菌进化过程中最为保守的基因，有些基因序列在长期进化过程中始终保持稳定，所以16SrDNA具有高度的保守性，常作为细菌PCR扩增的目标序列［13］。本研究在传统细菌研究方法基础上对分离的5株分离菌进行了16SrRNA基因序列扩增及测序，从分子水平上进一步验证了分离到的细菌是绿脓杆菌，证明了试验方法的准确性，同时为进一步研究病原的致病机理提供依据，为疫苗的研究开发奠定基础。

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