浅谈透射电镜生物样品取材实验课的体会

范晓燕，林方兴，汤 莹，杨勇骥

（第二军医大学 基础部生物物理学教研室暨电镜中心，上海 200433）

电子显微镜从诞生之日起就受到世人瞩目，经过七十多年的发展，电子显微镜技术现已广泛应用于各科研、医学领域，对科研的发展及疾病的治疗做出了极为重要的贡献。电镜室的工作人员主要负责电镜制样及观察工作，但是取材必须是由研究生和科研人员亲自操作，标本取好、固定后送至电镜室。在生物样品的取材过程中容易出现的问题最多，取材不当，会直接影响到实验结果，因此，取材是整个样品制备过程中的关键步骤之一。作为一名电镜实验室的教师，指导学生正确取材的方法及培养学生动手操作的能力是尤为重要的。

1 取材实验前的准备工作

1.1 实验设计

由于透射电镜实验所用试剂昂贵，费用较大，实验周期相对较长，因此，周全的实验设计是必不可少的。在实验设计中，实验者首先需要明确实验目的，然后选择合适的实验动物及试剂，备齐实验器具，合理安排实验流程，并做好预实验工作，以检验实验设计的科学性。实验时，还必须严格设立对照组。不仅要有正常对照，有时还应设立和实验组相同条件的对照。实验组和对照组的动物必须在相同条件下取材，在时间上尽量同步，采用相同的缓冲和固定液，取材部位完全相同，以增加实验的可靠性。此外，各组实验动物还应该具有一定的数量，得出的结论才较为可靠及有利于统计学分析［1］。

1.2 器械及试剂的准备

取材前应准备好实验器械及试剂：直弯剪各一把、大小镊子各一把、止血钳若干、双面刀片、卡片纸或玻璃皿、冰台、青霉素小瓶、各种预冷的缓冲液及固定液等。

不同的电镜技术所需试剂是不同的。如缓冲液的使用，常规电镜技术一般使用磷酸缓冲液；电镜细胞化学技术和免疫电镜技术一般使用二甲砷酸盐缓冲液［2］。

1.3 实验动物的准备

根据实验目的选择合适的实验动物，并在有资格认定的部门购买，同时应饲养在和其品级相应条件的环境下，否则实验结果可能得不到承认。实验动物还应避免从远处运来因外界环境因素的改变而发生的生理状态的变化。

2 取材时的注意事项

2.1 取材的要点

取材是电镜生物样品制备的第一步，也是十分重要的一步。为了保证取材位置的准确性，取材必须由每个实验者亲自操作。取材时需要注意的要点是：快、冷、小、净、准、避免机械损伤［2］。

快：取材应在实验动物血流还未停止时就快速取材。因为组织一旦缺血，细胞就会处于缺氧状态，细胞内的溶酶体会释放一些酶使细胞自溶，从而破坏细胞的超微结构。因此，组织一旦离体就应立刻固定。最好在1min之内浸泡于固定液中。

冷：为了降低酶活性，减少细胞自溶，取材的环境温度应尽量保持低温。组织离体后，需在冰台上切小块，冰台上需覆盖一层厚卡纸或玻璃皿，以避免组织与冰直接接触，造成冰晶的形成，影响后续电镜观察。操作时所用固定液和缓冲液需要预冷为4°。

小：由于固定液渗透速度缓慢的影响，组织块需切成小于1mm3的立方体小块或截面为1mm2长方体。通常情况下，无方向性的组织，如肝脏、肾脏、肺脏等，切成立方体小块，有方向性的组织，如皮肤、肠、神经、肌肉等，切成长方体小块。

净：尽量避免将血液或组织液带入固定液中，影响固定液的浓度及Ph值。冲洗组织块可用缓冲液或生理盐水，忌用自来水直接冲洗。

准：取材部位一定要精确。电镜制样要求组织块很小，电镜观察的视野更小，因此，要根据需要观察的内容，选择具体的取材部位。比如肾脏中皮质和髓质的超微结构是不同的，若要观察肾小球的结构就必须取皮质部分的组织。

避免机械损伤：取材时，动作要轻柔，刀片要锋利，切割时避免来回牵拉，以防止发生机械损伤。避免由于人为因素造成的实验结果的假象。

2.2 取材的具体过程

将预冷的固定液滴在冰台上的卡纸或玻璃皿上，将实验动物进行麻醉或颈椎脱臼。打开胸腔或腹腔，暴露所需器官，在血流未完全停止前剪取需要的组织块，用预冷的缓冲液或生理盐水将血液及组织液冲洗净，迅速放在卡纸或玻璃皿上的固定液中，用双面刀片将剪刀和镊子剪过或夹过的部分切掉，然后按要求切成小块移入装有固定液的小瓶中，贴好标签，置于4°保存。一些特殊样品的取材方法：如脑、脊髓、视网膜组织需要灌流固定后再取材；悬浮细胞及菌类收集到离心管中，以1500rpm／min的速度离心5min，然后加入固定液重悬后4°固定；在收集贴壁培养细胞时，如使用胰酶消化细胞，将会使细胞链打开，细胞骨架将会发生改变。因此需使用细胞刮子将细胞轻轻从培养皿中刮下后，用吸管收集到离心管中进行固定。

3 提高学生的学习兴趣和培养学生的动手能力

通过带领学生参观实验室，观摩了解医学生物样品的前期准备、中期制备、后期观察等一系列的电镜生物样品制备过程；鼓励学生课后多查文献，而后组织学生在带教教师的指导下，开展实践性的实验课，自己动手，进行实际操作，增强学生的感性认知。最后，小组间学生相互讨论，系统总结。实验操作中的真实感受可使学生兴趣大增，而且看到了生物电子显微镜相关研究的广阔应用前景，更能够激发学生强烈的探索欲望［3］。

科研离不开实验，对于实验者来说，动手能力更是不可缺少的素质之一。动手能力不只是实验操作能力，还包括对所用实验方法及仪器的原理的掌握、实验方案的设计等能力。理解掌握实验方法的原理和所用仪器的原理是最基本的，只有熟悉这些原理，才能更好地进行实验操作，更灵活地使用仪器，甚至更好地开发仪器的功能。设计实验方案，不断完善实验方案，这些工作也有助于不断强化动手能力［4］。由于电镜生物样品取材所包含的操作技能特别多，要求又特别精细。为了真正做到培养学生的实验操作技能，实验课应让他们人人动手，个个过程都要参与体会。在实验过程中，教师要求学生边解剖边思考不同的组织器官在取材时的特点及存在的差别。让学生在问题中寻找答案，在思考中进行动手操作。每到取材的关键之处，教师要给与精心指导，并严格把关。在实验操作过程中，出现的错误都必须及时给予纠正。总结出在取材过程中出现的一些问题，及解决问题的方案。

4 提高教师的业务素质及指导水平

教师的业务素质和指导水平对于学生的培养起着不可忽视的作用。因此，教师需要不断地学习新知识、新技术，不断地完善自己的知识结构。教师自我素质的提高、知识更新，有利于提高教学质量，培养高素质的医学人才。在实验课教学时，一位优秀的教师除了自己具备较强的技术操作能力外，还要注意加强指导能力和方法的训练［4］。在指导学生取材时，要因材施教，做到以学生为主，鼓励学生主动思考，教师从旁协助，在关键地方给予引导。

总之，生物样品的取材是透射电镜样品制备的第一步，标本的质量好坏，直接影响到电镜观察的效果和临床病理诊断的正确性。如果实验者设计不合理，操作不规范，将直接导致后续实验工作是徒劳的，并造成实验费用和时间上的浪费。因此在实验教学中，教师应注重把学生的能力培养放在首位，树立严谨的科学态度，提高每位学生的动手能力，掌握取材的正确方法，才能做到万无一失，达到预期的实验效果。

［1］曲淑贤，吕广艳，高船舟，等.指导研究生电镜取材的体会［J］.医学信息，2010，23（1）：48－49.

［2］杨勇骥.医学生物电子显微镜技术［M］.上海：第二军医大学出版社，2012：73－75.

［3］晋若冰，汤 莹，范晓燕，等.生物医学电镜技术实验课教学初探［J］.解剖学杂志，2012，35（6）853－854.

［4］汤 莹，金 婵，沈亚峰，等.浅谈生物技术专业本科生科研能力的培养［J］.西北医学教育，2011，19（3）469－470.