冬虫夏草肾保护的分子生物学机制研究进展

刘乃琴，邵 卉，赵香芳(综述)，常连庆(审校)

(解放军第四六四医院内分泌科，天津 300381)

冬虫夏草是中华虫草菌寄生于虫草蝙蝠蛾幼虫体后发育成的真菌子座与充满菌丝的僵死幼虫的复合体，其有效成分主要有：核苷类物质、虫草多糖、麦角甾醇、D-甘露醇、多种氨基酸、虫草素等。冬虫夏草能调节免疫功能、抗肿瘤，对中枢神经、心、肺、肝、肾、血液、代谢及内分泌也具有调节和保护作用[1]。随着分子生物学研究的不断深入，探索天然冬虫夏草及其人工制剂对肾脏保护作用的动物实验已取得了长足的发展。

1 冬虫夏草改善肾纤维化的分子生物学机制

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)已成为终末期肾病最常见的病因。肾脏细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度蓄积及降解减少所引起的肾小球硬化与间质纤维化是DN进展的主要病理学表现。ECM的主要成分——胶原、纤维连接蛋白(fibronectin，FN)等的异常增高提示ECM的过度积聚[2]。多种成分参与小管间质纤维化的发生过程。冬虫夏草可以从多个靶点延缓肾间质纤维化。

1.1转化生长因子β及原癌基因c-myc 转化生长因子β(transforming growth factor,TGF-β)是慢性肾病发病的关键细胞因子，它通过调节细胞增殖和分化、增加ECM的聚集、促进基质分子表面受体整合素的表达等促使肾小球肥大、纤维化。c-myc与细胞增殖密切相关，其可能直接参与细胞生长的调控。

研究证明，糖尿病大鼠模型应用TGF-β抗体后，c-myc表达减少，肾脏肥大和纤维化减轻。胡杨青等[3]的研究发现，DN鼠肾组织中TGF-β、c-myc表达上调，提示c-myc可能是TGF-β下游的靶基因,共同参与ECM增多及肾小球纤维化；冬虫夏草干预使DN鼠尿蛋白排泄量及血肌酐水平显著下降，TGF-β、c-myc表达明显下调，说明冬虫夏草可抑制肾组织TGF-β、c-myc的表达，对早期DN起保护作用。还有研究显示，DN大鼠肾组织TGF-β及其受体mRNA、FN mRNA均呈高表达；冬虫夏草呈时间-剂量依赖性降低DN大鼠24 h尿蛋白排泄率及血肌酐水平，推测冬虫夏草可通过下调肾组织TGF-β及其受体、FN mRNA的表达，降低肾内TGF-β活性，延缓DN进展[4]。

1.2结缔组织生长因子 结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)在肾小球和肾间质的高表达也是导致肾纤维化的重要原因。激活后的CTGF可介导TGF-β的致纤维化作用。有研究发现，DN大鼠肾组织内TGF-β1、胶原 Ⅳ及CTGF呈高表达；冬虫夏草干预可减轻肾组织的病理损伤，下调TGF-β1、CTGF、胶原 Ⅳ的表达，推测冬虫夏草通过下调TGF-β1、CTGF的表达而实现对DN的保护及抗肾小球纤维化作用[5]。还有研究证明，冬虫夏草通过下调残肾组织内CTGF表达而抑制5/6肾切除大鼠的肾脏纤维化，改善肾功能[6]。

1.3组织蛋白酶B、胱抑素C 组织蛋白酶B(cathepsin B，CB)是半胱氨酸蛋白酶超家族的主要成员，参与ECM的降解。CB表达减少和/或活性降低是ECM蓄积的重要原因之一。胱抑素C通过抑制CB活性，促进肾纤维化的形成。方华伟等[7]研究表明，随着病程进展，糖尿病大鼠肾组织CB、胱抑素C比例失衡，导致ECM沉积，肾组织纤维化加重；冬虫夏草治疗可上调CB表达，下调胱抑素C、胶原 Ⅳ及FN的表达，恢复CB、胱抑素C的动态平衡，延缓DN大鼠肾组织纤维化。

1.4成纤维细胞特异性蛋白1 有研究显示，5/6肾切除大鼠的肾组织镜下可见肾小球硬化和肾小管萎缩，间质炎细胞浸润，ECM沉积增多，足突融合，线粒体肿胀、空泡变性甚至嵴溶解、消失，自噬小体形成等；成纤维细胞特异性蛋白1、FN、胶原 Ⅲ的mRNA及蛋白表达均显著增加；冬虫夏草治疗可明显逆转上述异常[8]。郭山脉等[9]的研究结果也证实了冬虫夏草能够通过抑制氧化应激反应、减轻线粒体损伤、抑制ECM沉积等以拮抗肾脏纤维化。

1.5组织型纤溶酶原激活物、纤溶酶原激活物抑制剂 纤溶酶原激活后可直接或间接降解ECM。糖尿病时，高血糖、高胰岛素可促使纤溶酶原激活物抑制剂1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)/组织型纤溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator,t-PA)比例失调，致纤溶酶原活化减少。有研究证实，DN大鼠中PAI-1表达明显增多、t-PA表达明显减少，病理显示肾小球肥大，ECM增多，肾小管萎缩；冬虫夏草干预后，DN大鼠肾脏病理改变减轻，t-PA/PAI-1紊乱得到部分纠正，提示冬虫夏草可通过纠正纤溶酶原系统的紊乱治疗DN，且干预越早效果越好[10]。

1.6Dickkopf-1、β联蛋白 Wnt/β联蛋白是调控系膜细胞功能的重要细胞内信号通路之一。Wnt通过抑制β联蛋白的磷酸化降解、增加细胞质内β联蛋白水平，从而对c-myc、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、FN等的表达起重要调控作用[11]。Wnt/β联蛋白在高糖培养的系膜细胞中表达下调，可导致系膜细胞的凋亡和蛋白尿[12]。Dickkopf-1(DKK-1)为Wnt/β联蛋白信号通路的拮抗剂,通过介导β联蛋白的磷酸化，促进TGF-β、FN等的表达，导致系膜细胞纤维化[13]。杜月娟等[14]研究显示，DN大鼠肾小球系膜细胞、足突细胞FN、DKK-1的mRNA及蛋白表达显著上调，β联蛋白表达明显减少，而β联蛋白mRNA无明显改变；冬虫夏草治疗后，FN、DKK1 mRNA及蛋白表达显著减少，β联蛋白增加，β联蛋白mRNA和血糖无明显变化；证实DN时DKK-1升高参与了肾脏ECM的沉积，Wnt信号通路受抑制致使β联蛋白降解增加，冬虫夏草通过抑制DKK-1、稳定β联蛋白而发挥非依赖降糖的肾脏保护作用。

1.7Nephrin、Podocin 近年研究表明，足细胞超微结构改变及其裂孔膜蛋白Nephrin和Podocin在DN的发生、发展中起重要作用[15]。Nephrin、Podocin的mRNA表达与蛋白尿程度呈显著负相关。新近研究显示，DN大鼠经冬虫夏草治疗后，肾小球肥大、肾小管变形明显减轻，足细胞的病理改变显著改善，Nephrin和Podocin表达明显增加，提示冬虫夏草可能通过上调Nephrin和Podocin蛋白的表达而发挥保护及修复足细胞的作用[16]。还有研究显示，冬虫夏草与雷公藤多苷具有相同的足细胞保护作用，两者联合可明显增加疗效，且冬虫夏草可以明显减轻雷公藤多苷引起的肝损害、骨髓抑制等不良反应[17]。

2 急性肾损伤

近年来，急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)的发生率逐年升高。早期发现AKI并采取积极有效的治疗措施将有助于延缓或逆转AKI发展为多器官功能衰竭或终末期肾病。

2.1尿白细胞介素18、N-乙酰-β-葡萄糖苷酶 目前研究认为缺血诱导白细胞介素18表达增多。白细胞介素18不仅参与肾小管的损伤，也可以作为AKI早期诊断和疗效判断的生物学标志物[18]。N-乙酰-β-葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-glucosaminidase，NAG)在AKI时经尿排出增多，它是近端肾小管损伤的生物学标志物。新近研究显示，缺血再灌注模型组大鼠尿素氮、血肌酐、尿NAG和尿白细胞介素18水平显著增高，证实尿NAG和白细胞介素18均可作为肾小管损伤的敏感指标；冬虫夏草有较好的肾保护作用，可能与抑制白细胞介素18、NAG的排出有关[19]。

2.2肾损伤分子1、一氧化氮 肾损伤分子1(kidney injury molecule-1，Kim-1)是一种新的Ⅰ型跨膜蛋白，肾缺血及肾毒性损伤时诱导肾小管上皮细胞持续高表达[20]，Kim-1在早期AKI的诊断中有重要意义[21]。一氧化氮(nitric oxide，NO)是内源性血管舒张因子，与氧化应激关系密切，在肾缺血再灌注损伤中有促细胞凋亡的作用[22]。

洪学敏等[23]通过抗霉素A刺激大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)模拟体外缺血再灌注损伤过程，结果显示NRK-52E细胞受刺激后其凋亡率显著增高，与Kim-1 mRNA的早期高表达、NO浓度升高呈直线正相关；冬虫夏草可通过下调Kim-1的表达、降低 NO浓度、抑制细胞凋亡、减轻氧化应激而发挥肾保护作用。

2.3缺氧诱导因子1、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白 由缺血引起的AKI中，缺氧诱导因子1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)扮演着保护因子的角色，有望成为AKI早期诊断的标志物。余洪磊等[24]的研究发现，缺血再灌注导致AKI发生时，尿NGAL浓度明显升高，肾组织中HIF-1 mRNA及蛋白、NGAL蛋白的表达均明显升高，这种异常表达与肾小管及间质损伤程度密切相关；冬虫夏草能有效逆转上述异常，减轻肾小管及间质损伤，推测冬虫夏草对缺血再灌注引起的AKI的保护作用可能是通过上调HIF-1和NGAL的表达而实现的。

3 高血压肾病

肾小管间质的损害程度与肾功能密切相关，肾小管上皮细胞凋亡在肾小管间质病变的发生、发展中起重要作用。

3.1Klotho、p53、p21、胱天蛋白酶3 Klotho基因是一种主要表达于肾脏远端小管上皮细胞的抗衰老基因[25]；p53和p21是重要的细胞凋亡调节因子，Klotho基因可通过p53～p21通路对细胞衰老和凋亡进行调控；胱天蛋白酶3是两条主要细胞凋亡通路(死亡细胞凋亡通路和线粒体凋亡通路)的交汇点，活化的caspase-3是凋亡的执行者。

有研究显示，冬虫夏草可使自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)24 h尿蛋白、尿NAG、血肌酐及尿素氮显著减少，肾脏病理损害减轻，Klotho表达显著上调，p53、p21及活化的caspase-3表达显著下调，肾小管上皮细胞凋亡显著减少，提示冬虫夏草可能是通过促进Klotho的表达、抑制p53～p21凋亡通路及caspase-3活化而抑制肾小管上皮细胞凋亡[26]。后续研究发现，冬虫夏草可呈浓度依赖地促进NRK-52E增殖,剂量依赖地抑制血管紧张素Ⅱ诱导的NRK-52E凋亡、降低caspase-3酶活性[27]。

Klotho基因还具有增加细胞抗氧化应激的能力[28]。唐荣等[29]应用冬虫夏草对SHR进行干预后发现，肾功能指标得到改善，Klotho表达增强，丙二醛水平显著降低，抗氧化酶类活性有不同程度的恢复，肾组织病理损伤明显减轻，表明冬虫夏草可通过直接抗氧化应激或部分通过上调klotho基因的表达抑制氧化应激，对SHR起到肾保护作用。

1.3.2细胞间黏附分子1、血管细胞黏附分子1 炎性介质如细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)等的表达在高血压靶器官损害中起重要作用。研究发现，SHR大鼠的尿蛋白排泄量明显增加，肾间质小动脉、细动脉管壁增厚，血管周围大量炎细胞浸润，部分肾间质出现纤维化，肾组织中ICAM-1和VCAM-1 mRNA及蛋白水平明显增加；冬虫夏草干预组血压虽无明显下降，但其他异常得到明显纠正，提示冬虫夏草可能通过抑制SHR肾组织炎性因子的表达而发挥非血压依赖性的抗炎、保肾作用[30]。

4 小 结

DN、高血压肾病、AKI时，TGF-β、c-myc、CTGF、成纤维细胞特异性蛋白1、胱抑素C、PAI-1、DKK-1、Nephrin、Podocin、Kim-1、NGAL、ICAM-1、VCAM-1、p53、p21及活化的caspase-3等表达上调；而CB、t-PA、β联蛋白、HIF-1、Klotho等表达下调，促发肾间质纤维化、足细胞超微结构改变、肾小管上皮细胞凋亡等，最终损害肾功能。冬虫夏草可多环节、多靶点逆转上述异常，保护肾功能。但是肾脏疾病往往是多致病因素、多机制参与的结果，欲将动物实验的结果为临床所用仍需要进行大规模、长时间、高质量的前瞻、随机、双盲对照试验，必须在循证医学基础上获取更多证据。

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