梅毒实验室诊断方法进展与评价

曾雪梅

广西壮族自治区疾病预防控制中心，广西南宁市 530021

梅毒是由梅毒苍白螺旋体（Treponema pallidum，TP）感染而引起的一种性传播疾病，常累及生殖器官、附属淋巴结等，并能引起全身性病变的慢性传染病。近年来，由于梅毒感染率增加十分迅速，梅毒已成为国际社会共同关注的一个社会性问题［1］。梅毒与艾滋病有着共同的传播途径，因此梅毒的防治，对艾滋病的防控有着重要的意义。由于至今尚未建立梅毒螺旋体的体外培养方法，实验室主要从病原学、血清学及分子生物学等技术方面进行检测。随着科学技术的进步与发展，近年来，快速灵敏、准确性及特异性均高的梅毒诊断技术得到不断地更新完善，现综述如下。

1 梅毒螺旋体病原学检查

1.1 暗视野显微镜检查和活检 多用于起病初期，在病灶中采集分泌物后立即做暗视野显微镜观察，可以直接镜检到梅毒螺旋体（TP），对Ⅰ、Ⅱ期梅毒诊断具有重要价值，具有简便、快速、易于操作的特点。但该方法多受检验人员技术水平和经验等外部因素的影响，且不能区分梅毒螺旋体及其他类似梅毒螺旋体的物质，敏感性与特异性较低。梅毒螺旋体只能在活体内繁殖，不能在体外培养，主要对眼前房和兔睾丸敏感。但因操作复杂、检测时效和成本等原因，除研究外一般不做兔睾丸感染试验。

1.2 多功能显微诊断仪（MDI）［2］是近年来，由国外开发的一种暗视野、偏振光及综合相差对比的可变投影显微镜。该仪器集合了医学影像学、光电学、电子学和计算机等技术于一身。标本不需要任何加工处理即可直接进行观察，其优点在于分辨率高（最高可达0.2μm）、放大倍数高、清晰度高等。主要用于一期梅毒的诊断，具有准确方便、快速直接的特点［3］，其缺点为设备昂贵，该方法在临床上还未广泛推广应用。

2 血清学检测技术

由于梅毒自然病程存在潜伏期，血清学诊断是梅毒诊断（特别是潜伏期和晚期梅毒诊断）的重要手段。选择特异性、敏感性均高的血清学检测方法对梅毒的预防和诊疗都十分重要，梅毒血清学检测分为非特异性抗体及特异性抗体检测两大类。

2.1 梅毒螺旋体非特异性抗体检测技术 非特异性抗体检测方法名称很多，包括不加热血清反应素试验（USR）、性病研究实验室试验（VDRL）、梅毒甲基胺红不加热血清试验（TRUST）、快速血浆反应素环状卡片试验（RPR）等。这些方法的原理基本相同，主要是梅毒螺旋体进入人体后，刺激机体产生抗心磷脂抗体（即反应素），试验采用的抗原为卵磷脂、心磷脂与胆固醇的混合物，抗原－抗体以一定比例相互作用时出现凝集反应。主要差异是吸附抗心磷脂类抗原的物质不同，为了便于肉眼观察到阳性的凝集现象，常把抗原结合到有色物质上，如TRUST用甲基胺红，凝集颗粒呈红色，RPR试验用活性炭，凝集颗粒呈黑色等。这些试验简单快速、试剂成本低，适宜基层和人群筛查，是国内目前普遍使用的方法，其中最常用TRUST。它们均可做定性和半定量，主要是根据滴度数值判断梅毒的疗效、复发或再感染［4］。梅毒滴度是判断梅毒治疗及疗效转归的重要指标之一［5］。同时感染梅毒后，患者血清中产生抗类脂抗原抗体，多在梅毒感染3～4周后，在此之前检测可能出现假阴性反应，非特异性抗体实验特异性不高。在很多疾病过程如疟疾、结核和麻风等，机体可能会产生抗类脂抗原抗体，出现假阳性的结果。此外，怀孕、肿瘤、吸毒和结缔组织疾病等都有可能造成非梅毒螺旋体抗体检查的假阳性［6］。故应同时结合其他梅毒螺旋体特异性抗体试验。

2.2 梅毒螺旋体特异性抗体检测技术 其原理是随着基因工程技术的发展，利用梅毒螺旋体或其成分作抗原，检测患者血清中的梅毒螺旋体抗体，该检测技术特异性和敏感性均较高，为梅毒确诊实验。

2.2.1 梅毒螺旋体血凝试验（TPHA）。将特异性TP抗原致敏羊红细胞，这类红细胞与患者血清中的梅毒螺旋体抗体结合，产生肉眼可见的凝集反应。实验中使用血清吸收剂，去除了各种非特异性抗体的干扰，提高了TPHA的敏感性和特异性。但试剂成本较高，易自凝，不适用批量检测，常用作梅毒的确认试验［7］。

2.2.2 梅毒螺旋体颗粒凝集试验（TPPA）。与TPHA原理基本相同，主要的区别在于特异性TP抗原致敏的是明胶颗粒，试剂制备过程中不存在非特异抗原的干扰，并能测定抗体的效价，具有高敏感性和特异性，一般用于梅毒的确证。但该类方法检测的是梅毒螺旋体混合抗体IgM和IgG，患者血清中IgG抗体可终身阳性。因此不能仅凭TP抗体阳性而诊断为梅毒，梅毒的诊断应以症状、体征、病史以及实验室检测结果进行综合分析［8］。

2.2.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）。为双抗原夹心法，其原理是将高纯度的特异性TP抗原包被微板，测血清中梅毒螺旋体抗体。目前已有多种商品化试剂盒，在国内外广泛应用［9，10］。ELISA法简便快捷，影响因素较少。近年来随着基因克隆技术的发展，采用基因重组表达的特异性TP抗原包被固相板，使该方法具有更高的敏感性和特异性。李仕娟［11］报道 TRUST 法与 ELISA 法只有71.15%的阳性符合率，而TPPA法与ELISA法有99.12%的阳性符合率，因此用于筛查梅毒时，ELISA法检出率会明显高于TRUST法，是目前筛查梅毒的较理想方法。而且适用于大批量样品的检测，自动化的操作方法，结果更为客观准确［12］。

2.2.4 胶体金层析法（CGD）。其原理是在检测膜的检测线上包被有基因重组TP抗原，当加入样品后，如果样品中含有梅毒螺旋体抗体，将会与包被的特异性TP抗原结合，形成免疫复合物，而凝聚显色［13］。该方法检测的样本可以是血浆、血清、全血，并且准确率相对较高，具有简单、快速、不需要特殊仪器等特点［14］。主要用于献血者筛查、性病门诊快速检测，以及紧急用血等特殊情况。但与ELISA法检测结果比较，存在显著差异，可能因出现“前带现象”，有一定漏检率［15］。强阳性标本会出现假阴性结果，需对样本进行稀释处理。

2.2.5 免疫印迹法（WB）。是一种借助抗原鉴定特异性TP抗体的有效方法，该法是通过特异性TP抗体作为探针，与附着于固相支持物的通过电泳分离出来的特异性抗原表位发生特异性结合，是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。它结合了分子生物学和免疫学的特点，虽然特异性与敏感性都较高，但因检测过程操作繁琐，不适合于大批量的标本检测。同时试剂成本较高等，其在临床中尚未得到广泛应用［16］。

2.2.6 化学发光法（CLIA）。是酶免疫技术发展的结果，采用多种特异性TP抗原包被固相发光微孔板，用辣根过氧化物酶标记作为标记抗原，与样本中的梅毒螺旋体抗体特异性结合，形成双抗原夹心复合物后，加入化学发光底物液，测定其发光值，判断结果。CLIA是一种新型标记免疫测定技术，用于微量抗原或抗体检测。国内一些研究表明：CLIA法具有操作简便，结果易于保存，敏感度和特异度较高等优点［17，18］，CLIA 法可以实现全自动化检测，适用于大批量样本的检测，该方法得到越来越广泛的认可。

2.3 聚合酶链反应（PCR）技术 随着分子生物学技术的快速发展，应用聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）是检测梅毒螺旋体的先进方法。该方法的主要原理是通过持续进行变性、退火、延伸，在体外大量扩增模板DNA。选择PCR诊断梅毒需要考虑患者所处的梅毒病程，及样本来源以溃疡和皮损拭子最为适宜。梅毒实验室诊断方法主要是血清学检测，但因人体感染梅毒后，要4～10周才产生一定数量的抗体，PCR可直接检测梅毒螺旋体特异性基因片段，其特异性、敏感性均高于血清学方法［19］，尤其在早期梅毒诊断中意义重大。目前用于梅毒诊断的PCR技术主要有三种：即常规PCR、巢式PCR和荧光PCR。常规的PCR法检测梅毒会出现一定假阴性，目前采用巢式PCR可提高对梅毒的检出率。对于用血清学方法检测为阴性或无法确证的结果，可采用巢式PCR检测进行确诊［20］。荧光PCR对一期梅毒的诊断，具有很高的敏感性和特异性，可作为一期梅毒诊断的依据，对诊断二期梅毒不如血清学方法［21］。PCR检测技术自身存在一些不足之处，易受样本中细胞碎片和组织等物质影响，对部分样本如血清（全血）、脑脊液等敏感度低，出现漏诊，同时对实验室条件及操作人员技术要求较高。

3 结语

梅毒的检测技术在近年来得到快速发展，特异性和灵敏度不断得到了提高，检测方法快速简便。但所有的梅毒实验室诊断方法都有其局限性，有特殊的应用范围，原理和临床意义各不相同，由于梅毒血清学检测存在血清固定现象，检测结果存在一定限制。目前还没有单一的一种实验室方法，能完全诊断出梅毒感染及病程。血清学检测仍然是梅毒螺旋体实验室诊断的主要方法，多为非特异性抗体与特异性抗体联合检测。梅毒螺旋体非特异性抗体检测常用于大范围筛查，特异性抗体检测主要用于确证。随着分子生物学技术的发展，PCR检测技术已广泛深入到生命科学研究领域，是梅毒实验室诊断的新方法，对早期梅毒、神经梅毒和伴艾滋病感染梅毒等诊断显示出独特的优势。在诊断梅毒时，实验室应充分结合临床，根据具体情形加以选择检测方法，需要综合考虑检测目的、特异性和敏感性、操作流程、样本数量、试剂价格等因素。对检测技术进行组合优化，建议两种或两种以上检测方法联合应用，能有效提高梅毒检出率，对梅毒的早诊断、早治疗及控制梅毒蔓延有着重要意义［22］。随着科学技术的不断进步，更多有效可靠的梅毒实验检测新技术将应用于临床，需要今后不断地总结研究。

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