抗肿瘤新化合物盐霉素杀伤肿瘤细胞的作用机制

张郭娟(综述)，王 毅，肖 晖(审校)

(1.南华大学第二临床学院，湖南 衡阳 421001； 2.南华大学附属第二医院泌尿外科，湖南 衡阳 421001；3.中国科学院巴斯德所免疫信号调节实验室，上海 200031)

盐霉素是一种从白色链霉菌属提取的羧基聚醚类钾离子载体抗生素，其过去常常被用作禽类抗球虫和促生长药。盐霉素假环状结构中的聚醚部分能够与金属阳离子结合形成复合物，其分子表面的亲脂层又可以转运这些离子复合物穿过生物的细胞膜，使得盐霉素具有杀死革兰阳性菌和抗禽类球虫病的作用[1]。在一次高通量筛选实验中发现，盐霉素能够选择性靶向杀伤乳腺癌干细胞，并能抑制其在体内的生长与转移[2]。另外，盐霉素对肺癌、子宫内膜癌、胃癌等肿瘤细胞也具有杀伤作用[3-5]。尽管人们对盐霉素抗肿瘤机制还不完全了解，但研究者们在近几年的研究工作中提出了以下几种机制。

1 盐霉素与肿瘤干细胞

肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)是一种存在于肿瘤的特殊亚群细胞，其拥有自我更新和分化成肿瘤细胞的能力，因此能够使肿瘤产生恶性异质性细胞系。由于其特殊的生物学活性，存在于肿瘤中的CSCs可以耐受常规化疗药物、靶向治疗药物以及放射治疗，这使得肿瘤在经过多种治疗后仍然能够存活并发生转移[6]。在Gupta等[2]的实验中，以CD44highCD24low作为筛选CSCs的标志物发现，盐霉素能以高于常规化疗药物紫杉醇100倍以上的效力杀伤乳腺癌CSCs，这为盐霉素杀伤CSCs的研究奠定了基础。在肺癌细胞系A549中，盐霉素对流式细胞术分选出的醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)阳性的肺癌CSCs同样具有抑制作用，并且使Oct-4、Nanog、Sox2等干细胞标志基因同步下调[3]。无论是在正常细胞还是肿瘤细胞，上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)被认为是诱导富含干细胞样性能的原因之一[2]。子宫内膜癌中经历了EMT的细胞被看作是CSCs，盐霉素作用于细胞后，EMT相关基因Bcl-2、淋巴细胞增强子结合因子1显著下调，细胞周期蛋白D和纤连蛋白作为EMT相关蛋白也受到了抑制，促凋亡蛋白Bax随着盐霉素浓度的增高表达逐渐增强[4]。同样，盐霉素对高ALDH的胃癌CSCs、CD133+的胰腺癌CSCs以及CD133+的结直肠癌CSCs均呈浓度梯度抑制作用[5,7-8]。

2 盐霉素与ATP结合盒转运体

ATP结合盒(ATP-binding cassette,ABC)转运体属于高保守跨膜蛋白超家族的细胞膜糖蛋白，最早在细菌中发现，跨膜蛋白超家族中的成员含有2个ATP结合区，通过与ATP结合发生二聚化，使ATP水解后解聚，将化疗药物等从细胞内转运出去。ABC转运体的表达是导致肿瘤抗药性的原因之一[9]。在急性粒细胞性白血病细胞中，盐霉素的处理导致ABC转运体、P糖蛋白等高表达，诱导早幼粒细胞性白血病细胞凋亡，并抑制ABC转运体介导的对化疗药物的“排出”作用。盐霉素作为离子载体型抗生素与细胞接触后迅速嵌入细胞质膜和线粒体膜，这使得盐霉素能够躲避ABC转运体的“排出”、有效的作用于细胞[10]。

3 盐霉素与Wnt/β联蛋白信号通路

经典的Wnt/β联蛋白通路在肿瘤的发生及治疗中起重要作用，该通路的异常激活会引起肿瘤的发生。当Wnt通路被激活后，细胞外的Wnt配体与受体卷曲蛋白家族成员相互作用，尤其是单通道跨膜蛋白低密度脂蛋白受体相关蛋白(lipoprotein receptor-related protein，LRP)5和6。Wnt与卷曲蛋白结合可以激活乱磷蛋白，以招募axin并形成破坏型复合物结肠腺瘤样息肉/糖原合酶激酶3β/轴蛋白(adenomatous polyposis coli/glycogen synthases kinase 3 beta/axin,APC/GSK3β/axin)至细胞膜上。axin与胞质尾区的LRP5和LRP6结合后逐渐降解，从而减弱了其对β联蛋白的降解作用。乱磷蛋白的激活也可抑制GSK3β，这也减少了β联蛋白的磷酸化和降解。β联蛋白在胞质内的水平上升后进入细胞核，作用于T细胞因子家族并激活靶基因[11]。在慢性淋巴细胞性白血病细胞中，盐霉素能够下调Wnt的靶基因，如淋巴细胞增强子结合因子1、周期蛋白D1和纤连蛋白等的表达，从而抑制细胞的生长。在转染了Wnt的HEK293细胞中，盐霉素能抑制LRP6的磷酸化并诱导其降解，这说明盐霉素可通过干扰白血病细胞中LRP6的磷酸化而抑制Wnt/β联蛋白通路的激活[12]。在骨肉瘤中，盐霉素处理后，β联蛋白降解增多，Wnt/β联蛋白通路同样受到抑制[13]。

4 盐霉素与活性氧类

活性氧类(reactive oxygen species,ROS)产生于正常新陈代谢和接触有害异物之后，其对细胞的作用取决于水平的高低。少量的ROS在细胞信号调节中充当“氧化还原信使”的角色，而一旦积聚过量，则会诱导细胞大分子氧化修饰，从而使某些蛋白功能丧失及细胞死亡[14]。盐霉素通过促进前列腺癌细胞内ROS水平的上升，破坏细胞内氧化还原平衡。ROS积聚发出的促凋亡信号能引发线粒体释放细胞色素C和凋亡诱导因子等促凋亡蛋白，从而激活凋亡蛋白酶。与此同时，盐霉素还能引起线粒体膜的去极化而增强胱天蛋白酶(caspase)3的活性[15]。

5 盐霉素与Akt/NF-κB信号通路

Akt又称蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)，是丝氨酸/苏氨酸的特定蛋白激酶，它在细胞代谢、增殖、转移、凋亡中起重要作用。Akt通过结合核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和Bcl-2家族蛋白调控细胞的生存和代谢，也可以通过调节IκB激酶激活NF-κB。IκB蛋白被降解后，能够释放NF-κB，并使其转移至细胞核中，从而抑制细胞死亡[16]。在多种肿瘤细胞中发现Akt/NF-κB信号通路的异常激活，如前列腺癌。前列腺癌细胞及其干细胞中的NF-κB处于激活状态，当其受到抑制时会诱导细胞凋亡[17]。盐霉素通过抑制NF-κB的活性诱发氧化应激，从而抑制前列腺癌细胞的生长和转移[18]。在卵巢癌中盐霉素也起到类似的作用。Akt诱导的NF-κB激活在一定程度上决定了卵巢癌的抗药性。盐霉素通过抑制Akt的表达而抑制NF-κB的核转移，通过下调Akt/NF-κB信号通路解决了卵巢癌耐受顺铂治疗的问题[16]。

6 盐霉素与细胞自噬

细胞自噬是一种高度保守的溶酶体降解通路，其能将已破坏的细胞器吞没至双层膜囊泡自噬体中，当自噬体与溶酶体融合后，其包裹的细胞器会降解，而降解的小分子会被细胞重新利用。这也是自噬能够使细胞维持自稳态的原因[19]。自噬与细胞的生长、分化、免疫、衰老及死亡息息相关，越来越多的研究显示其与肿瘤的发生、发展密切相关[20]。在肺癌细胞A549中，低水平的钙黏蛋白1可诱导上皮EMT，并导致CSCs富集。盐霉素作用于钙黏蛋白1基因下调的A549细胞，可抑制细胞自噬，从而诱导细胞凋亡。盐霉素处理后的肺癌细胞、乳腺癌细胞以及前列腺癌细胞均会引起细胞自噬，因此将盐霉素与自噬抑制剂共同作用于细胞，可有效避免自噬激活，从而有效地杀死肿瘤细胞[19-21]。

7 盐霉素与DNA损伤

电离辐射、阿霉素作用等可引起DNA损伤，肿瘤抑制因子p53是DNA损伤修复通路所需的重要蛋白，它能抑制细胞周期、并诱导DNA损伤修复[22]。除p53外，PH2AX、pBRCA1、pChk1等因子被认为是DNA损伤程度的标志蛋白，这些蛋白的磷酸化程度反映了DNA断裂和损伤程度。研究者发现，盐霉素与阿霉素及依托泊苷共同作用于肿瘤细胞后能激活DNA损伤相关蛋白PH2AX、pBRCA1、pChk1、p53BP1[23]。盐霉素单独处理细胞后发生DNA断裂、PH2AX蛋白水平升高及DNA损伤灶形成，它通过抑制DNA依赖蛋白激酶，增强DNA损伤从而诱导细胞凋亡[23]。

8 盐霉素与细胞周期停滞

细胞周期分为DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)和细胞分裂期(M期)。在G1期，代谢、应激及环境刺激均能影响细胞分裂甚至整个细胞的发展过程，细胞周期是进入S期还是被终止于G1则取决于这一期细胞的改变。换句话说，G1期从一定程度上决定了细胞的自我更新、分化以及死亡[24]。细胞周期素D1是一种对G1向S期转换起正向调节作用的因子，细胞周期素依赖激酶抑制剂p27Kip1则对细胞周期有抑制作用。p27Kip1是在蛋白水平被调节的，S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2,Skp2)通过泛素化p27促进其被蛋白酶体降解。Skp2作为一种致瘤蛋白与多种肿瘤细胞相关，是引起肿瘤抑制蛋白p27Kip1降解的关键因子。近期研究发现，在卵巢癌细胞中，盐霉素通过将细胞滞留在G1期诱导细胞凋亡[25]。盐霉素作用于细胞后能够下调细胞周期素D1和Skp2的表达，从而使抑瘤蛋白p27Kip1在细胞内大量堆积，最终导致细胞周期停滞与细胞凋亡[25]。

9 盐霉素与死亡受体

死亡受体(death receptor,DR)是一类包含胞内死亡域的肿瘤坏死因子受体超家族中的一员，DR4和DR5可以启动细胞内的自杀装置。在体外，DR4和DR5的过表达能够诱导无配体结合的细胞凋亡[26]。线粒体非依赖性信号通路可以直接激活caspase-8，然后caspase-8进一步激活caspase-3。Caspase-3激活后进一步诱导聚ADP-核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)的剪切，PARP的切割是经典级联凋亡反应的标志物。在耐受顺铂治疗的卵巢癌细胞中，盐霉素可以通过激活DR5、caspase-8和Fas-相关死亡域蛋白诱导细胞凋亡[27]。

10 盐霉素与非甾体消炎药激活基因1

许多肿瘤细胞在接受了γ射线辐照、细胞毒药物以及非甾体类消炎药等的治疗后，其非甾体消炎药-激活基因1(non-steroidal anti-inflammatory drug-activated gene-1,NAG-1)的表达明显上调。NAG-1也称为巨噬细胞抑制因子或生长分化因子，它是转化生长因子β超家族中的一员[28]。NAG-1与心血管疾病、炎症、体质量变化以及癌症都有着密切的联系，血清中的NAG-1水平对心血管疾病以及癌症的诊断和预后判断起到了一定的帮助[29]。研究发现，NAG-1作为一种抗肿瘤发生因子能够抑制肿瘤生长，并在肿瘤早期诱导其凋亡。在人非小细胞肺癌中，盐霉素的处理可引起NAG-1的表达的增强，并减弱肺癌细胞的侵袭能力[28]。

11 展 望

盐霉素能够抑制耐受普通抗肿瘤治疗的生长，并诱导程序性凋亡。关于盐霉素抗肿瘤的作用，虽然有多种机制被提出，但在分子细胞水平的确切机制仍需更多的实验加以证实。作为新型抗肿瘤化合物，盐霉素使用的安全性及其代谢特点也有待于进一步研究。盐霉素因其高效杀伤肿瘤的能力以及易提取、价格廉的特点，具有良好的成药潜能。相信经过研究者们的共同努力，盐霉素能在不久的将来投入临床使用并为人类抗肿瘤治疗开启新的篇章。

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