肿瘤基因治疗的病毒载体研究进展

宋向明(综述)，赵 瑜，田长富(审校)

(昆明医科大学生物医学工程研究中心，昆明 650500)

肿瘤是目前导致人类死亡的第二大疾病。传统的手术治疗、放射治疗、化学药物治疗对于肿瘤晚期的转移和扩散未能起到较好的抑制作用，且对正常细胞的杀伤力大。近年来，在细胞生物学和分子生物学领域，随着基因转移的深入研究，基因治疗在临床实践，特别是在晚期肿瘤术后转移和扩散治疗中起到了重要的作用。随着对肿瘤发生、发展分子机制研究的不断深入，肿瘤基因治疗已经成为攻克肿瘤最具希望和挑战的研究领域。目前，应用于肿瘤基因治疗的载体分为病毒载体和非病毒载体两大类。理想的病毒载体应具备以下特点：在特异的组织细胞中可持续地、有规律地表达外源基因；与细胞膜亲和性高，有一定的靶向性、稳定性和安全性。

1 腺病毒载体

腺病毒是一种无包膜的双链DNA病毒，直径70～90 nm，基因组长约36 kb。其有核衣壳，呈规则的20面体结构。目前已知的人体腺病毒血清型有51种，基因治疗中应用最多的为人5型腺病毒[1]。

腺病毒载体的优点：可以感染各时相细胞；可以转染大多数种类的细胞；重组病毒滴度高，易于制备和纯化；高效转染，高效表达；可直接注射于组织原位感染细胞。腺病毒载体的缺点：高免疫原性；体内不能持续表达，表达时间短；重复给药受限制；容量小，可插入外源基因片段的长度为7～10 kb；靶向性差。

研究表明，腺病毒E1A基因可阻滞正常细胞抑癌基因的功能，E1B基因可对抗p53，使病毒能够在宿主细胞中复制[2]。目前，已经开发出缺失E1A和E1B的腺病毒载体，由于其缺少p53和Rb通路，在正常细胞中可抑制病毒复制，在肿瘤细胞中促进病毒复制。5型腺病毒通过柯萨奇受体感染细胞，然而，某些肿瘤细胞，如卵巢癌和胃肠癌细胞不能表达柯萨奇受体。此类肿瘤可以使用其他血清型腺病毒予以治疗，如人35型腺病毒和黑猩猩C1型腺病毒。这些血清型与人5型腺病毒有类似的免疫原性[3]。

人体端粒酶在正常组织中不表达，但在几乎所有的肿瘤中具有活性[4]。Li等[5]构建了由端粒酶启动子启动的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体(TRAIL)基因表达的腺病毒载体Ad-g TRAIL，检测该腺病毒载体在神经胶质瘤与恶性脑膜瘤中的抗肿瘤活性：与Ad-CMV-GFP相比，Ad-g TRAIL可明显减小体内肿瘤体积以及有效抑制体外肿瘤细胞生长。

通过增加病毒载体的靶向性以及与其他抗肿瘤药物合用，可以改善病毒载体对肿瘤转移和生长的抑制作用。目前，一种用于改善病毒载体的新方法是使用一种新型的化疗药物——组蛋白去乙酰化酶抑制剂，可以逆转转化细胞的恶性表型[6]。天然的组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228是一种二环的缩酚酸肽，可以抑制组蛋白去乙酰化酶抑制剂，从而导致去乙酰化组蛋白的积累和诱导细胞G1与G2/M期阻滞，转化细胞的分化和细胞凋亡。除此之外，FK228可以增强腺病毒的感染效果，部分原因是由于柯萨奇受体表达上调。Danielsson等[7]研究表明，在一些肿瘤细胞中，FK228可以通过一个独立的转导机制增加腺病毒的治疗效果，并且在药物预培养的细胞中，FK228可以提高腺病毒的转基因表达。Fujiwara等[8]使用一种有复制能力的特异性末端转移酶腺病毒Telomelysin[其包含一个结合有FK228等抗肿瘤物质的人端粒酶逆转录酶(human telomere reverse transcriptase,hTERT)启动子]治疗不同类型的肿瘤细胞。hTERT启动子的原理是驱动带有与内部核糖体进入位点连接的E1A和E1B基因的表达，内部核糖体进入位点可以在肿瘤细胞中复制，并且可以对多种人类肿瘤细胞起到强大的杀伤作用[9]。Fujiwara等[8]发现，Telomelysin/FK228结合能够增强人肺癌细胞A549中腺病毒的感染和复制能力，增强人肺癌细胞H1299中Telomelysin的抗肿瘤作用。

2 腺病毒相关病毒载体

腺病毒相关病毒(adenovirus-associated virus,AAV)是非致病性的无包膜单链DNA病毒，直径20～26 nm，呈20面体结构，是微小病毒家族的成员之一，基因组长4681 bp，基因组的末端为145 bp的末端反向重复序列。其末端反向重复序列之间是AAV编码区，左侧的开放式阅读框编码4种Rep蛋白，为DNA复制和转录所必需的非结构蛋白；右侧的开放式阅读框编码3种核表壳蛋白：VP1、VP2 和VP3，为产生感染性病毒颗粒所必需的外壳蛋白。目前，AAV有13种血清型，不同血清型存在不同的组织亲嗜性，如8型AAV对肝脏和心脏有组织亲嗜性，9型AAV对肺有亲嗜性[10]。AAV必须有辅助病毒存在时才能感染细胞，一般为腺病毒或疱疹病毒；无辅助病毒存在时处于潜伏状态，此时AAV基因组整合到宿主的基因组中(如人基因组第19号染色体q臂)建立潜伏感染。

AAV载体的优点：无病毒基因表达；宿主范围广，能够感染非分裂细胞；低免疫原性；可持续表达；安全性好，无致病性。AAV载体的缺点：可插入外源基因片段的容量低，仅为5 kb；重复给药会产生耐药性。

Kollipara[11]成功构建一种高效安全的AAV载体，其在体内和体外均能抑制乳腺癌细胞的生长。这种基于AAV载体(AAV2-EzH2-shRNA)的治疗是通过RNA干扰的方法使癌症促进基因EzH2基因沉默。EzH2(Zeste-2的增强子)是癌细胞转移的决定因素，是乳腺癌等肿瘤转移的关键组分，通过允许染色质甲基化，导致一些抑癌基因的转录沉默和肿瘤细胞分裂[12]。Kollipara[11]研究表明，AAV-EzH2-shRNA转染人乳腺癌细胞(MCF-7)达72 h，可诱导该细胞凋亡，细胞的抑制率达到80%；该载体在小鼠体内实验中亦能抑制MCF-7细胞的生长。于磊等[13]成功构建了AAV(recombinanted AAV，rAAV)-单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpeslsimplex virus-thymidine kinase，HSV-TK)基因载体rAAV-TK，该载体可分泌TK基因，在加入更昔洛韦和吉西他滨后，该基因能够有效诱导膀胱肿瘤细胞(MB49-PSA)凋亡；转染72 h后，rAAV-TK组细胞凋亡率为37%，显著高于空病毒组和空白对照组。Limberis等[14]研究表明，9型重组腺病毒rAAV9可反复给药，可介导目的基因持续高效地表达。王峰等[15]利用三质粒磷酸钙共转染的方法成功构建9型重组AAV(rAAV2/9)，可介导内源性抗肿瘤血管生成因子在人脐静脉血管内皮细胞中高效表达。Kallistatin是丝氨酸蛋白酶抑制剂，可以有效抑制肿瘤新生血管生成[16]。

3 反转录病毒载体

反转录病毒是一种有包膜含反转录酶的正链RNA病毒，基因组长10 kb。该病毒为球形，有核衣壳，呈20面体立体对称结构，病毒核心为两条相同正链单链RNA(+ssRNA)，由5′端部分碱基互补成二倍体。其含有序列和功能相似的gag、pol、env三个结构基因(排列顺序为5′-gag-pol-env-3′)和多个调节基因，Gag编码病毒的核心蛋白，pol编码反转录酶和整合酶，env编码病毒的外膜蛋白。反转录病毒通过env蛋白和细胞表面受体相互作用侵入宿主细胞。在宿主细胞的细胞质中，病毒基因组RNA在反转录酶的催化下充当反转录模板合成cDNA，在整合酶催化下整合到宿主基因组形成前病毒。前病毒成为宿主基因组的一部分，参与宿主基因组DNA的复制。宿主转录器识别病毒长末端重复序列的顺式作用元件，并且介导病毒基因表达。

目前，反转录病毒载体有两种类型：反转录病毒载体N2和反转录病毒载体MFG，两者在5′端非编码区有微小的差别，都包含鼠白血病病毒5′剪接供体位点和病毒基因组RNA衣壳化的完整包装信号。此外，MFG载体包含env基因的鼠白血病病毒剪接受体位点，而N2载体不包含此位点。

反转录病毒载体的优点：容易制备；外源基因整合入宿主细胞后可稳定表达；体外分裂细胞感染率可达100%，转染效率高；低免疫原性。反转录病毒载体的缺点：只能感染分裂细胞；随机整合入宿主基因组，有潜在危险性；容量小，可插入外源基因片段的长度为8 kb；病毒滴度低，为106～107pfu/mL。

田晨等[17]成功构建小鼠Hes1基因过表达反转录病毒载体MSCV-Hes1-IRES-GFP。该实验利用流式细胞仪检测转染效率，利用实时荧光定量聚合酶链反应法检测Hes1基因的表达量，结果显示，转染293T细胞后第3日转染率约为95%，Hes1基因表达量约为对照组的5倍；病毒上清感染Lin-细胞后第5日感染率约为7%，Hes1基因的表达量约为对照组的6倍。因小鼠Lin-造血细胞一般处于非分裂期，而反转录病毒感染分裂细胞，故在感染前加入细胞因子、干细胞因子、血小板生成素、 FMS样的酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosine kinase-3，Flt3)配体，可使Lin-造血细胞处于分裂期，虽然感染率仍不理想(7%)，亦可进一步做深入功能研究。

4 HSV载体

HSV为双链DNA病毒，根据其抗原性的不同可分为Ⅰ型和Ⅱ型。HSV基因组约为152 kb，含有34个基因，可编码70余个多肽。HSV能够复制和感染多数的上皮细胞和神经细胞，包括肿瘤细胞[18]。

HSV的优点：容量大，可插入外源基因的片段为25 kb；宿主范围广；可感染分裂细胞和非分裂细胞；具有嗜神经性，可在感觉神经元潜伏感染，可应用于神经系统疾病。HSV的缺点：高免疫原性；体内不能持续表达目的基因。

Jones[19]和Halford等[20]利用溶瘤性疱疹病毒载体，使致病基因ICP4和γ34.5发生突变。在恶性胶质瘤、膀胱癌和乳腺癌转移的人体模型中，缺少γ34.5和UL39基因功能的HSV载体用瘤内注射的方法可以使肿瘤细胞凋亡。在胰腺癌、卵巢癌和乳腺癌中，黏蛋白基因过度表达[21]。在人肝癌中，突变的HSV载体在MUC1启动子的控制下表达γ34.5可导致复制受限。此外，临床试验表明，成人对于HSV良好的耐受性导致肿瘤的稳定和消退[22-24]。利用血浆除去法联合溶瘤细胞治疗法去除人体内的HSV抗体，会降低静脉注射和瘤内注射HSV的疗效。蔡晓辉等[25]成功构建能够表达胶质细胞源性神经营养因子基因的重组HSV-1载体，细胞半数感染量法测得病毒滴度为2.25×106IU/mL。吕芳彪等[26]通过聚合酶链反应成功扩增了HSV-Ⅱ型潜伏相关转录体开放读码框1基因，然后将其连接到带有GFP基因标记的pEGFP-C2 载体上，构建了pEGFP-开放读码框1真核表达载体，并将其转染非洲绿猴肾细胞，用实时荧光定量聚合酶链反应方法检测到开放读码框1基因在细胞中表达，用荧光显微镜观察到荧光蛋白的表达。

5 其他病毒载体

2011年发明的一项专利“利用经改造的呼吸道合胞体病毒治疗乳腺癌”，研究者用改造的一种溶瘤细胞呼吸道合胞体病毒治疗乳腺癌。该病毒缺少NS 1基因(NS 1蛋白为Ⅰ型干扰素的拮抗剂)，研究发现该病毒能够使乳腺癌细胞凋亡而对正常细胞无影响，其机制为增加Ⅰ型干扰素，Ⅰ型干扰素能够在体外和体内(BALB/c裸鼠体内皮下种植MDA-MB-231乳腺癌细胞)实验中阻止病毒在正常细胞中复制，同时诱导其在MDA-MB-23乳腺癌细胞中的抑瘤作用[27]。痘病毒为线型双链DNA病毒，有包膜，不与宿主基因组整合。其主要的缺点是免疫原性高。该载体用于肿瘤基因治疗研究，Hu等[28]构建携带TK基因的类牙巴病病毒载体，并加入GFP荧光蛋白基因，在卵巢癌小鼠模型中，腹腔注射该病毒12 d后，在肿瘤组织中有38%的细胞表达GFP蛋白。目前，痘病毒多应用于疫苗的研制与开发，包括艾滋病疫苗和禽流感疫苗，基于痘病毒载体研制的反转录病毒144艾滋病疫苗已进入Ⅲ期临床试验。

此外，还有重组仙台病毒、人类巨细胞病毒、牛乳头状瘤病毒载体等也有相关报道。

6 展 望

肿瘤的发生在本质上由基因决定，遗传因素和环境因素以协同或序贯的方式引起DNA损害，从而灭活抑癌基因和激活原癌基因，凋亡调节基因和改变DNA修复基因引起表达水平的异常，导致肿瘤的发生。因此，肿瘤基因治疗的发展前景广阔，肿瘤基因治疗载体也成为肿瘤基因治疗至关重要的组成部分。目前，肿瘤基因治疗的载体较多，有各自的优缺点，在能够高效持续表达外源基因的同时，如何能够降低免疫原性，提高安全性，以及如何利用外源基因来弥补病毒载体的部分缺陷是未来的研究方向。

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