吡格列酮、二甲双胍治疗PCOS雌鼠后卵巢组织炎性因子以及超微结构改变的研究

邹 琳 韦 冰，＊ 庞小艳 陈铭林 莫雷同 揭 海

1.广东医学院附属医院生殖医学中心（湛江，524001）；2.广东医学院附属医院心血管内科

多囊卵巢综合征（PCOS）涉及下丘脑-垂体-卵巢轴、肾上腺、胰岛素代谢、遗传甚至环境等多方面因素，目前暂无单一的病因能够完全解释PCOS的异质性和种族、个体的差异性［1］。有研究认为，PCOS不排除是一种慢性轻度炎症性自身免疫性疾病的病理本质［2］。持续的炎性微环境提供大量改变细胞正常内环境稳定的炎性介质，其引发的级联反应对机体造成更大的伤害，故炎症学说成为目前PCOS的研究热点之一。临床上缺乏大样本的卵巢组织标本观察，而人类的卵巢在解剖学及其生化生理过程、生殖细胞形成、卵泡的发育和排卵方面与其他脊椎动物非常相似。本实验利用来曲唑灌胃法建立PCOS雌鼠模型［3］，再使用二甲双胍与吡格列酮以及两者联合灌胃，探讨促炎因子超敏C反应蛋白（hs-CRP）、降钙素原（PCT）与抑炎因子白介素（IL）-10、脂联素（ADP）平衡失调在PCOS雌鼠中的作用，以及通过药物干预是否能改善这种平衡失调，观察大鼠卵巢超微结构的改变，评价这两类药物治疗PCOS的效果，为临床诊治PCOS提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及处理

采用6周龄成年雌性SPF级SD大鼠（动物合格证号：44006400000012）50只，体重250～350 g，均购自广东医学院实验动物中心。将50只雌鼠随机均分为5组：对照组①成年正常雌性SD大鼠，经0.9%生理盐水灌胃干预（A组）；②经0.9%生理盐水灌胃干预的PCOS大鼠（B组）。试验组①经吡格列酮灌胃干预的PCOS大鼠（C组）；②经二甲双胍灌胃干预的PCOS大鼠（D组）；③经吡格列酮联合二甲双胍灌胃干预的PCOS大鼠（E组）。

1.2 实验方案及步骤

1.2.1 建立PCOS大鼠模型 雌鼠每日作阴道涂片检查，观察动情周期，连续两动情周期（4～5 d）的用于实验造模。来曲唑（江苏恒瑞医药股份有限公司）溶于1%羟甲基纤维素水溶液（CMC）配制后溶液给药剂量为2 ml／（kg·d），灌胃剂量为0.5 mg／（kg·d）。

1.2.2 各组大鼠处理 A组从造模日起用1%CMC 2 ml／（kg·d）灌胃21d，待B～E组造模成功后A、B组均用生理盐水灌胃，C、D、E组用药物灌胃，5组均再连续灌胃12 d。C组大鼠吡格列酮（杭州中美华东制药有限公司）灌胃，剂量3.125 mg／（kg·d）；D组大鼠经二甲双胍（中美上海施贵宝制药有限公司）灌胃，剂量300 mg／（kg·d）；E组大鼠经吡格列酮联合二甲双胍干预，药物及剂量同前。所有组药物干预后24 h并禁食8 h后，大鼠腹腔麻醉后处死解剖，取一侧卵巢制备成组织匀浆液，置于-20℃冰箱保存待测；另一侧卵巢切片用电镜液浸泡保存，拟行透射电镜检查。

1.2.3 酶联免疫吸附实验（ELISA）检测卵巢中各因子表达 将卵巢组织加入适量0.9%生理盐水，用组织匀浆机匀浆。1000 g离心10 min，取上清液。各因子的ELISA试剂盒均由美国Cusabio公司生产，严格按照试剂盒说明书的步骤规范操作。标本用标本稀释液1∶1稀释后加入50μl于反应孔内，稀释后的标准品50μl加入反应孔，立即加入50μl生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡，37℃温育1 h。甩去孔内液体，每孔加满洗涤液洗涤3次。每孔加入80μl亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30 min。甩去孔内液体，每孔加满洗涤液洗涤3次。每孔加入底物A、B各50μl，轻轻振荡混匀，37℃温育10 min，避免光照。取出酶标板，迅速加入50μl终止液，加入终止液后立即测定结果。于波长450 nm的Epoch微孔板分光光度计上读取各孔的数值。以吸光度OD值为纵坐标，相应的标准品浓度为横坐标，绘出标准曲线并计算出其直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

1.2.4 透过型电子显微镜观察细胞超微结构 卵巢组织取出后立即在卵巢的中央区贯通全层切下厚1 mm×1 mm组织薄片块，在固定液中浸泡片刻，置入磷酸缓冲液配制的戊二醛液固定，用四氧化锇后固定，逐级丙酮脱水，环氧树脂浸透、包埋、聚合后切协厚片，亚甲蓝染色，在光镜下定位，用超薄切片机切片，醋酸铀及枸椽酸铅染色，用透过型电子显微镜观察卵巢的超微结构。

1.3 统计学处理

采用SPSS 20.0软件分析。计量资料均以均数±标准差（±s）表示，各组间数据比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 卵巢组织匀浆液中各因子水平分析

B、C、D组hs-CRP水平均高于A组及E组，且两两比较显示差异均有统计学意义（P均＜0.01）。B组PCT水平均高于A、E两组，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。B、C组IL-10水平均低于 A、D、E组（P均＜0.01）。ADP各组两两比较差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见表1。

表1 各组雌鼠卵巢组织匀浆液因素水平比较（±s）

表1 各组雌鼠卵巢组织匀浆液因素水平比较（±s）

★与A组两两比较P＜0.05；▲与B组两两比较P＜0.05；●与C组两两比较P＜0.05；■与D组两两比较P＜0.05；◆与E组两两比较P＜0.05

组别 hs-CRP（ng／ml） PCT（pg／ml） IL-10（pg／ml） ADP（ng／ml）A组 541.62±74.26 42.57±2.42 6.68±0.83 2.75±1.22 B组 820.81±46.84★◆ 93.31±7.17★◆ 3.41±0.88★■◆ 2.85±1.76 C组 686.33±99.12◆★ 76.97±35.95 5.25±1.38▲■◆ 2.38±0.36 D组 779.02±38.46◆★ 62.03±15.22 7.84±1.00 2.29±0.86 E组 501.92±56.18 47.21±11.10 7.87±0.26 2.43±1.25

2.2 卵巢透射电镜分析

A、E两组颗粒细胞中均可见正常的细胞核和核仁，染色质在核中分布均匀，胞质内可见线粒体呈长椭圆形，内有许多嵴。另见粗面内质网、溶酶体。B组颗粒细胞见细胞核核膜皱缩，核型不整，染色质浓缩边聚，胞质内见大量的脂滴空泡，未见明显线粒体结构。C组颗粒细胞中见正常细胞核和核仁，染色质分布均匀，但胞质内脂滴空泡明显增多。D组见正常细胞核和核仁，染色质分布均匀，胞质内脂滴空泡增多，见管泡状嵴线粒体。见图1。

3 讨论

Lorenz等［4］研究认为，PCOS患者血清CRP水平明显高于正常妇女。在全身炎性反应早期（2～3 h）PCT即可升高，是最理想的早期特异性诊断炎症的指标。抗炎因子例如IL-10、ADP等，通过限制炎症因子的产生，上调其可溶性拮抗结合蛋白，抑制炎症细胞的活性，减轻炎症反应。IL-10具有广泛的生物学功能，包括抑制Thl细胞增殖以及IL-2、IL-3等细胞因子合成，发挥抗炎症作用；抑制自然系统细胞因子产生；通过促进单核细胞表达IL-lra抗炎［5］。ADP作为一种新的抗炎因子备受关注，研究发现ADP刺激抗炎因子的释放，抑制前炎性因子的产生，在急性期炎症反应中起重要作用。ADP可抑制成熟巨噬细胞的功能和抑制粒、单核祖细胞系的生长，主要作用于后期慢性炎症过程以避免过度的免疫反应。

二甲双胍为双胍类衍生物，可抑制食欲、减轻体重、减轻内脏脂肪聚集。Kadoglou等［6］认为二甲双胍可明显降低体质量指数及显著改善胰岛素敏感性。吡格列酮是噻唑烷二酮类降糖药，具有胰岛素增敏作用、免疫调节和抗炎活性。Narsing等［7］使用吡格列酮30 mg／d治疗PCOS患者6个月发现空腹胰岛素水平较前明显降低。二甲双胍和比格列酮还可以直接作用于卵巢，改善卵巢内部的糖代谢异常。

图1 各组卵巢颗粒细胞透射电镜下超微结构

本研究中，B组PCOS雌鼠卵巢组织匀浆液的促炎因子hs-CRP、PCT水平均高于A组，而其抑炎因子IL-10水平较A组低。提示PCOS病程中促炎、抑炎因子失平衡，可能为PCOS发病的机制之一。而E组经吡格列酮联合二甲双胍处理后，卵巢中hs-CRP、PCT水平均显著低于仅经生理盐水干预的B组，且接近A组水平。C、D、E组中，E组联合用药的效果优于单一用药的C和D组。可以考虑两种药联合干预能降低PCOS发病中异常升高的促炎因子hs-CRP、PCT水平，同时提升异常降低的抑炎因子IL-10水平，使促炎、抑炎因子的比例恢复正常。但在本实验中ADP水平各组间均无差异，可考虑增加样本量、延长来曲唑造模和药物干预的时间再观察其作用。

文献报道，卵泡闭锁与颗粒细胞凋亡有关，颗粒细胞凋亡在卵泡闭锁中起主导作用［8］。本实验在透射电镜下发现，B组PCOS雌鼠卵巢细胞呈凋亡、坏死改变。而E组的卵巢细胞超微结构与正常大鼠相似，提示联合用药预能明显改善PCOS雌鼠卵巢的细胞结构，阻止细胞坏死凋亡。单独使用一种药的C、D组胞质内仍有较多脂滴空泡以及线粒体肿胀的改变，表明细胞缺氧的情况仍未恢复。这提示联合用药细胞超微结构的改善明显优于单一用药。

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2 Benson S，Janssen OE，Hahn S，et al.Obesity，dePression and chronic low-grade inflammation in women with polycystic ovary syndrome［J］.Brain Behav lmmun，2008，2（2）：177-184.

3 Mannerås L，Cajander S，Holmäng A，et al.A new rat model exhibiting both ovarian and metabolic characteristics of polycystic ovary syndrome［J］.Endocrinology，2007，148（8）：3781-3791.

4 Lorenz MW，Karbstein P，Markus HS，et al.High-sensitivity C-reactive protein is not associated with carotid intima-media progression：the carotid atherosclerosis progression study［J］.Stroke，2007，38（6）：1774-1779.

5 Ebert EC，Panja A，Das KM ，et al.Patients with inflammatory bowel disease may have a transforming growth factor-beta-，interleukin（IL）-2-or IL-10-deficient state induced by intrinsic neutralizing antibodies［J］.Clin Exp Immunol，2009，155（1）：65-71.

6 Kadoglou NP，Tsanikidis H，Kapelouzou A，et al.Effects of rosiglita-zone and metfor-min treatment on apelin，Visfatin，and ghrelin levels in patients with type 2 diabetes mellitus［J］.Metabolism，2010，59（3）：373-379.

7 Narsing Rao L，Jacob JJ，Paul TV，et al.Effects of pioglitazone on menstrual frequency，hyperandrogenism and insulin resistance in adoloscents and young adults with polycystic ovary syndrome［J］.J Pediatr Adolesc Gynecol，2009，22（2）：91-95.

8 Vaskivuo TE，Anttonen M，Herva R，et al.Survival of human ovarian follicles from fetal to adult life：apoptosis，apoptosis-related proteins，and transcription factor GATA-4［J］.J Clin Endocr Metab，2001，86（7）：3421-3429.