药用植物人参内生菌研究*

张雷鸣，任伟超，刘秀波，张艳贺，孔祥军，佟春香，马 伟△

1黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 哈尔滨150040；2齐齐哈尔医学院第一附属医院；3齐齐哈尔中医医院

动 态·研究进展

药用植物人参内生菌研究*

张雷鸣1，任伟超1，刘秀波1，张艳贺1，孔祥军2，佟春香3，马 伟1△

1黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 哈尔滨150040；2齐齐哈尔医学院第一附属医院；3齐齐哈尔中医医院

对药用植物内生菌的研究进行概述，指出人参内生菌的多样性、普遍性，并对人参内生菌的分离、次级代谢产物的鉴定检验、内生菌的抑菌能力以及生物防治进行类比分析，发现人参内生菌研究过程中存在的问题以及其主要的研究方向，同时指出未来研究发展的前景。

人参；内生菌；研究技术；应用进展

内生菌（e n d o p h y t e）是一个庞大的具有普遍存在性的微生物特殊类群，他们的部分或全部生活史存在于健康的植物组织内部，分布广泛、种类多样，同时不引起宿主植物表现出明显感染症状。目前研究的药用植物内生菌主要包括药内生真菌、内生细菌以及内生放线菌。其中研究药用植株中对放线菌的研究与关注相对另外两种少一些。苔鲜植物、蕨类植物、裸子植物和被子植物中都发现有内生真菌［1］。杜慧竟等［2］采用1 0种分离培养基对3 7个新鲜的药用植物样品进行内生放线菌的分离，分离得到9 4 0株植物内生菌，分属于4 7个属，3 0个科，其中放线菌6 0 0余株，分属于3 4个属，潜在的新分类单元有7个。内生菌在宿主的科、种以及组织水平上存在专一性。这种专一性可能是内生菌与宿主在长期共同进化中形成的，黄璐琦等［3］阐述产生这种专一性的可能原因是不同植物内生菌可利用不同的基质，对生活环境有不同的要求，因而内生菌具有不同的生活方式。郝荣乔［4］在《微生物通报》中评述“植物内生菌已成为我国微生物研究领域的热点”。目前对内生菌的研究以及应用主要集中在农学和药学两大学科领域：农学研究的目的主要是发掘和利用内生菌对植株有利的生物学作用，提高植物的生长、生产、抗病虫害的能力等，在保证环境优化的同时提高作物产量。植物内生菌现已知的生物学作用主要包括促进植物生长、生物固氮作用、增强宿主植物抗病虫害、抗逆境等作用。药学领域的研究针对药用植物而言，主要目的有3个，一是与农学研究的目的一致，利用生物学作用提高药材的产量与品质，尤其是名贵药材；二是发现在适宜条件下产生或促进药用植物产生宿主药材的有效药用成分的内生菌；三是发现能产生新的有效活性成分的内生菌。本研究针对药用植物中的名贵药材人参近年来的研究进展进行概述。

1 人参内生菌的研究现状

人参（Panax ginseng C.A.M e y）为五加科名贵中药材，中国、韩国、朝鲜均出产，我国主产地在东北地区，多长于山地缓坡或斜坡地的针阔混交林或杂木林中［5］，其中以吉林省人参最负盛名。人参的化学成分包括人参皂苷、维生素、多糖、氨基酸、甾醇、挥发油以及多种微量元素等。现代药学研究发现人参皂苷是其主要活性成分，已从红参、生晒参或白参中共分离出3 0余种人参皂甙，可分为3组即齐墩果酸组、原人参二醇组和原人参三醇组，具有提高组织抗福射、抗衰老、抗肿瘤、抗缺氧能力、改善微循环等药理学作用。人参的名贵以及内生菌群的特殊性使得人们开始关注人参内生菌的研究，阅读文献发现目前人参内生菌的研究主要是对内生真菌和内生细菌的研究，与人参内生放线菌相关的文献资料未见报道。

1.1 人参内生菌的分离及多样性 目前内生菌的分离方法主要是组织块分离法和组织匀浆法，由于内生菌存在的普遍性和广泛性以及宿主专一性，所选择的人参产地以及分离部位多种多样。姜云等［6］采用传统平板培养法从吉林省5个不同地区来源的健康人参植株的根、茎、叶中分离获得了人参内生菌，内生细菌1 5 2株，内生真菌4 6株，但并未对其进行系统鉴别，其中人参内生细菌采用研磨法分离，内生真菌采用组织块法分离。徐丽莉［7］在其硕士论文中以5年生园参和1 5年生移山参为研究对象，进行内生真菌的分离，共分离纯化得到内生真菌4 8株，其中园参内生真菌2 7株，移山参内生真菌2 1株；并通过形态及分子生物学方法鉴定了其中4 0株，鉴定得到1 4个分类单元，将其归属到8科1 0属1 2种。内生菌的生长需要不同的基质，因此选择不同的培养基会培养出不同种类的内生菌，采用多培养基同时培养可以分离的菌种种类数量得到提高，使得分离的全面性得到改善，其中李勇等［8］利用3种不同细菌培养基对人参根部细菌进行提取分离，共分离4 0种内生细菌，L B培养基1 0株，N A培养基2株，Y D C培养基2 8株。

1.2 人参内生菌次级代谢产物的研究 次生代谢产物对植物而言是植物对环境的一种适应，它对植物之间的相互竞争和协同进化，以及对抗逆境抗病虫害等过程起重要作用［9］。研究流程均为将人参内生菌置于适宜的液体培养基中，根据不同菌株，优化选择发酵时间，然后对其发酵液进行化学检验或确定物质结构。现仅见对内生真菌发酵液的产物检验及化学成分结构研究，针对内生细菌的研究鲜有。孙月［10］对人参次生代谢产物的化学成分的研究仅限于对菌株R P的活性成分进行初步的研究。采用大孔树脂柱的方法找到抑菌活性物质的存在部位。在8 0%～9 0%乙醇溶液收集到的洗脱液中发现大部分的活性物质，检测到有皂甙类成分存在，利用T L C方法对其化学成分进行初步鉴定，与人参皂苷比移值相近，表明在发酵液中可能含有人参皂苷R e。徐丽莉［7］通过人参内生菌体外抗肿瘤实验选取活性较高的Y u a n-2 5菌株，对其发酵产物的乙醚部位进行G C-M S检测，鉴定出3 8种成分，主要成分为I n d a n e-1，3-d i o n e，2-（3，4-d i m e t h o x y-b e n z y l i d e n o）-（4 0.0 1%），A nd r o s t-2-e n-4-o n e，1 7-（t e t r a-h y d r o p y r a n-3-y l）o x y（7.7 6%），苍耳素（x a n t h a t i n，4.4 1%），异丹参酮Ⅱ（i s o t a n s h i n o n eⅡ，3.0 3%）。张薇［11］从人参根部分离得到2株对人参皂苷R b 1具有专一转化活性的内生菌莫勒接霉（Z y g o r h y n c h u s m o e l l e r i）和灰绿犁头霉（A b s i d i ag l a u c a），其能够将皂苷R b 1转化为人参皂苷R d。

1.3 人参内生菌的抑菌作用以及生物防治 人参内生菌抑菌实验常利用培养基平板对峙培养法和抑菌圈法，初步筛选出对病原菌有抑制效果的菌株，而后再对该菌株进行进一步实验研究，比如抗病性以及生物防治。生物防治是指除人以外的一种或多种生物降低病原物数量或减弱病原的致病活力，从而减少病原物所致病害的发生［12］，微生物属其中一种。姜云等［13］筛选出菌株N J 1 3，该菌株为甲基营养型芽孢杆菌（B a c i l l u sm e t h y l ot r o p h i c u s），该菌对人参7种主要病害病原菌和1 7种其他植物病害病原菌均具有一定的拮抗作用，菌株的发酵液对人参立枯菌（R h i z o e t o n i a s o l a n i）的抑菌效果最强。邱服斌等［14］从人参根部获得一株内生细菌g e 2 1，对其进行抑菌试验，结果表明该菌株对尖孢镰刀菌（F u s a r i u mo x y s po r i u m）、寄生疫霉菌（P h y t o p h t h o r ap a r a s i t i c a）、剑麻炭疽病菌（C o l l e t o t r i c h u ma g a v e s）、烟草赤星病菌（A l t e r n a r i al o n g i p e s）、稻瘟病菌（P y r i c u l a r i a o r y z a e）、人参立枯病菌（R h i z o c t o n i a s o l a n i）、人参疫病菌（P h y t o p h t h o r ac a c t o r u m）和人参菌核病菌（S c l e r o t i n i as c h i n s e n g）均有一定的抑菌活性。然而对理想的生物防治因子而言，既要能产生有效的拮抗因子抑制病原菌，又要在植株体内有很好的定殖能力［15］。人参内生菌的研究只停留在对抑菌作用的菌株的筛选方面，以其确定合适的生防菌株，并未涉及在人参植株体内的定殖。刘时轮等［16-18］针对绿色木霉菌T v 0 4-2对人参立枯病菌的一系列研究为人参内生菌的生物防治的研究提供了一定的思路。

2 人参内生菌研究展望

内生菌的多样性以及宿主的专一性决定了不可能将一株植物的内生菌全部分离出来，而且消毒时间的长短均对内生菌的多样性产生一定的影响，可采用多个培养基，多种培养条件同时培养，以期分离得到更多的菌株，但工作量巨大。因此需要发现新的分离方法在保证分离数量质量的同时减少工作量。从人参内生菌分离的数量看，其内生资源较为丰富，但已被研究者关注并研究的菌株比例仅占3%～5%左右，未被开发的内生菌资源还很大，因此对人参内生菌的研究需要参考微生物学领域的研究，运用多种现代研究技术，发现内生菌与人参之间的作用关系、抗病机理以及次生代谢的功能性基因，深层次挖掘，不能仅停留于分离、发酵、抑菌实验流程的表层，为人参内生菌产生的活性物质实现工业化生产奠定一定的理论基础。人参内生菌生物防治的开发有一定的实际意义，但距离真正的生物农药的开发以及广泛使用还有一定的距离，其中需要考虑的因素诸多，比如对土壤的污染，人参生长环境的菌群失调等。人参的名贵让内生菌开发沿着成本低、高成效的路线开展，随着人参内生菌研究的逐步深入，其应用领域定会越来越广泛，为人类生活带来更大的益处。

［1］陈美兰，黄璐琦.道地药材形成的途径之一植物内生菌［N］.中国中医药报，2007-02-09（007）.

［2］杜慧竟，苏静，余利岩，等.药用植物内生放线菌的分离和生物学特性［J］.微生物学报，2013，53（1）：15-23.

［3］黄璐琦，张瑞贤.“道地药材”的生物学探讨［J］.中国药学杂志，1997，32（9）：563-566.

［4］赫荣乔.植物内生菌成为我国当前微生物研究领域的热点［J］.微生物学通报，2009，36（1）：1.

［5］王本样.人参的研究［M］.天津：天津科学技术出版社，1985：67.

［6］姜云，尹望，陈长卿，等.人参内生菌的分离及拮抗菌株的筛选［J］.吉林农业大学学报，2012，34（5）：517-521.

［7］徐丽莉.人参内生真菌及其次级代谢产物活性研究［D］.上海：第二军医大学，2009.

［8］李勇，赵东岳，丁万隆，等.人参内生细菌的分离及拮抗菌株的筛选［J］.中国中药杂志，2012，37（11）1532-1535.

［9］赵俞，王琦.人参内生菌的多样性及其次生代谢产物［J］.菌物研究，2012，10（2）：113-118.

［10］孙月.抑菌内生真菌的分离及人参内生菌抑菌活性物质初步研究［D］.吉林：吉林农业大学，2007.

［11］张薇.人参根际土壤真菌与内生真菌的多样性及人参皂苷生物催化活性菌株的筛选［D］.大连：辽宁师范学院，2011.

［12］沈爱华.黄瓜苗期碎倒病的生物防治及病原拮抗细菌的分子鉴定［D］.杭州：浙江大学，2003.

［13］姜云，尹望，陈长卿，等.人参内生拮抗细菌N J13的鉴定及发酵条件［J］.农药，2013，52（2）：97-101.

［14］邱服斌，李雁津，张晓霞，等.人参内生细菌ge21菌株的鉴定及抑菌活性测定［J］.微生物学通报，2010，37（1）：43-47.

［15］肖淑贤，高俊明.植物内生菌的研究概况及应用进展［J］.农业技术与装备，2011（1）：74-77.

［16］刘时轮，李勇，丁万隆，等.绿色木霉Tv04-2的筛选及其对人参立枯病菌拮杭机制的研究［J］.世界科学技术：中医药现代化，2008，10（4）：93-96.

［17］刘时轮，李勇，傅俊范，等.绿色木霉Tv04-2菌株固体发酵条件研究［J］.华北农学报，2008，23（增刊）：244-247.

［18］刘时轮，李勇，傅俊范，等.绿色木霉Tv04-2菌株固体发酵物对人参防御酶活性的影响［J］.中国农学通报，2009，25（3）：63-65.

Research on Endophytes of Medicinal Plant Ginseng

ZHANG Leiming1，REN Weichao1，LIU Xiubo1，ZHANG Yanhe1，KONG Xiangjun2，TONG Chunxiang3，MA Wei1△
1 College of Pharmacy of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China；2 The First Affiliated Hospital of Qiqihar Medical College；3 Qiqihar Municipal TCM Hospital

We reviewed the studies on endophytes of medicinal plant，and pointed out that the diversity and universality of endophytes of ginseng，we found the issues existed in the study of ginseng endophytes，main directions of the studies and the prospect of further studies by comparing and analyzing the separation of ginseng endophytes，identification of secondary metabolite，antibacterial ability and biological control.

ginseng；endophytes；research techniques；application progress

R22

A

1004-6852（2014）05-0129-03

2013-12-11

农业公益性行业科研专项（编号201303111-04），黑龙江中医药大学“优秀创新人才支持计划”

张雷鸣（1988—），女，硕士研究生。研究方向：生药学。

△通讯作者：马伟（1969—），女，博士研究生导师，博士学位，研究员。研究方向：药用植物生物工程。