富血小板纤维蛋白新生诱导骨的研究进展

肖 琼,董 露(综述),陈红亮,孙 勇(审校)

富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)属于新一代血小板浓聚物,富含大量血小板、白细胞和细胞因子,具有致密的三维网状结构,可诱导多种细胞增殖和分化。目前实验研究和临床试验揭示PRF有良好的应用前景,本文就PRF的发展历程、制备方法、主要成分及立体结构、新生诱导骨形成的机制以及口腔种植中的应用等研究进展作一综述。

1 PRF的发展历程

20世纪80年代,许多学者开始对血液浓聚物进行深入研究,先后提出了具有代表性的富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)和PRF。1997年Whitman等[1]提出将PRP应用于颌面外科切除术后和口腔种植手术。虽然PRP可促进组织修复,但由于钙离子和凝血酶的加入,可能引起潜在的疾病传播和免疫原性危险。新一代血小板浓聚物PRF,制备过程简单,并且不对血液作任何生化处理,是Choukroun于2000年在法国成功制取[2]。Choukroun通过回顾性研究得出,PRF在制备时缓慢聚合形成的纤维网接近生理状态,更有效地促进细胞迁移、增殖和愈合,逐渐被运用于骨科、颌面外科和口腔种植等领域。

2 PRF的制备方法

PRF制备方法便捷:用10 ml无抗凝剂的试管,采集自体血液样本,立即以3000 r/min(约400g的离心力)离心10 min,PRF获得于试管中部。用专门的工具分离出PRF凝块,无菌金属勺子[3]压制成膜。若同时需制备8～16块PRF膜时,最好选用Dr.Joseph Choukroun 设计的PRF工具盒(Process,Nice)操作较便捷,并且压力温和、缓慢、均一,使PRF被渗出液浸湿保持相应的湿度,避免了抽拽导致的重要血小板生长因子,如血小板衍生因子AB(platelet-derived growth factor AB,PDGF-AB)丢失,但对血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和转化生长因子β-1(transforming growth factor β-1,TGFβ-1)没有影响[4]。制备可得到坚固稠密的自体纤维蛋白膜[1]或者柱形凝块。临床上获取有效PRF凝块的关键在于血液采集和离心速度；时间过长可能失败:纤维蛋白将以发散的方式在试管里聚合,所得为低浓度的小部分血凝块。PRF制备方法提出时,是以人为采集对象,推论于实验动物就值得注意血管有无足够的压力和容量。Dohan等[5]对多个物种进行严格的PRF采集制备,发现兔子除致死率高的心内采血外,其余各个部位血管都不能实行均一和快速的采集,从而无法得到稳定的纤维蛋白聚合,大量红细胞附和其中,应尽量避免选用。优先选择大型动物,如比格犬、狒狒、猪或者更大的马、山羊等。

3 PRF的主要成分和立体结构

3.1主要成分 PRF在离心过程中血小板被激活,在损伤区域聚合和凝血机制交互作用,成为启动和帮助止血的基础。脱颗粒作用下,重要的细胞因子被释放:最有效力的纤维化剂TGFβ,影响PRF的空间结构,可作为炎症调节剂[6]；迁移、增殖和间质细胞生存的重要的调节剂PDGF[7],根据特异性受体的分布诱导兴奋这些细胞,该调节节点是各种组织改建机制的基础[8]；细胞保护剂胰岛素增长因子(insulin-like growth factors,IGF),积极地调节细胞增殖、分化和凋亡程序,诱导生存信号保护细胞[9]。上述3种主要的血小板细胞因子在初期愈合机制里尤为重要。

PRF同时含有大量白细胞[10],添加PRF可以减少损伤区域的有害反应如术后感染。PRF制备过程中,人为诱导增强了白细胞脱颗粒作用,分泌细胞因子参与应答止血和炎症反应。主要包括促炎细胞因子:白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α),和抗炎细胞因子:IL-4和VEGF。有学者[11]研究发现它们嵌合在纤维蛋白网里并缓慢释放,炎症控制后,IL-4的存在作用值得进一步研究。PRF具有抗炎、免疫调节的作用,与促进血管新生的作用相辅相成。虽然PRF的特征已较清楚,但是对调节炎症反应的机制尚未完全阐明。

3.2立体结构 严格按照制备标准得到的PRF,在试管里由下往上分为三部分:血红细胞底层(red corpuscules base)、黄色柱状工作网PRF、无细胞上层(serum platelet poor plasma,serum PPP)。Dohan等[12]研究表明,少量PDGF-BB、TGFβ-1和IGF-I在上层液和PRF血清里,说明PRF不同于其他血小板浓聚物,它能够在纤维立体网状结构的改建中逐渐释放细胞因子；观察到纤维蛋白的纤丝结构,聚糖链与纤维蛋白聚合,血小板陷入氨基聚糖(glycosaminoglycan,GAG)内,细胞因子大多存留在PRF网内。这种三维聚合模型标志细胞因子在纤维蛋白网里循环坚固的结合,延长了寿命。它们在原位可发挥修复作用；进入纤维愈合阶段时,可促发损伤区域的重建,PRF精密的生物学组合在愈合阶段有很好的协同效应。

4 PRF新生诱导骨形成的机制

PRF诱导各类型细胞如人牙龈的成纤维细胞、前角蛋白细胞、前脂肪细胞、成骨细胞等持续增殖兴奋[12],其中白细胞类似一种伴侣分子大量增殖与之相互作用。诱导新骨的关键因素之一是间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),可聚集并分化软骨细胞形成软骨组织,再被骨组织所替代。骨膜内MSCs也可直接分化为成骨细胞形成骨组织。因此,种植体植入后,MSCs迁移至种植体的数量和在种植体表面增殖、黏附的速度将直接影响骨的重建和愈合。有研究证明PRP促进骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖,但是抑制分化。Dohan等[13]在体外对人的BMSCs进行培养,发现添加PRF膜可刺激其增殖,向成骨细胞分化,并且有明显的剂量依赖性。国内学者[14]实验也证实,PRF能够促进兔的BMSCs在钛板表面黏附和增殖。口腔MSCs和PRF的结合,可能提供很多临床和生物技术应用,值得关注。但在以往研究中,白细胞并未得到重视,其相关作用及机制值得探索。

5 PRF新生诱导骨在口腔种植中的应用

国内外实验研究证明,PRF有良好的骨诱导特性,在口腔种植领域具有优良的应用前景。Lee等[15]用自体骨联合PRF作为移植材料,对犬上颌窦提升并同期种植,6个月平均骨种植体的结合率和新生骨平均高度均优于单独自体骨移植。有学者将PRF作为屏障膜与海奥生物膜对比,修复兔下颌骨缺损,结果表明PRF能够提高成骨质量,缩短成骨时间,但尚达不到屏障膜需要的充足降解时间,PRF膜与海奥生物膜联合应用的双层膜技术可进一步深入[16]。也有研究发现,PRF覆盖骨粉与混合骨粉诱导骨再生效果无统计学差异[17]。徐普等[18]用PRF填塞犬拔牙即刻种植时周围骨缺损,颊侧骨量增加高度和成骨细胞数量明显高于血凝块、明胶海绵对照组,证明PRF利于种植体周围骨缺损区新骨形成。

临床试验表明,PRF能促进骨组织再生。早期,PRF与骨移植材料通常联合使用。在上颌窦提升手术中,Choukroun等[19]在窦底提升植骨时用同种异体冻干骨(freeze-dried bone allograft,FDBA)与PRF凝胶混合植入,二期种植时采集新生骨样本做组织学分析,发现剩余骨被新生诱导骨包围,并连接软组织,提高了成骨速度和质量。Tatullo等[20]对60例上颌骨萎缩后高度<5 mm的患者,将PRF联合BIO-OSS使用,愈合时间较以往文献记载的150 d缩短为106 d。逐渐有PRF单独使用的报道,Simonpieri等[21]用PRF单独作为窦底植入材料,追踪观察2～6年,20例获得8.5～12 mm的骨增量,新的窦底水平在种植体顶端,周围骨量和骨高度坚固而稳定。国内学者[22]报道2例用PRF充填即刻种植间隙的骨缺损,3个月后牙槽嵴顶位置无显著变化。在位点保存研究中,Hauser等[23]采用翻瓣和不翻瓣的拔牙术式后,充填PRF于拔牙创,分析骨微结构和骨质量,发现侵害性的外科程序会中和PRF的优点,最低限度的外伤性手术方式和PRF位点保存的共同应用,才可良好的保存硬组织。在牙周炎的治疗中,Thorat等[24]对慢性牙周炎导致的牙槽骨缺损行翻瓣刮治后充填PRF对比观察,发现PRF组的探诊深度、附着水平及影像学参数明显优于阴性对照组。

综上所述,PRF富含白细胞、血小板和各种细胞因子,无免疫和感染方面的危害,便捷经济的获取方法,在口腔硬组织重建和骨再生领域中优势明显。但由于自体供血量有限,单独使用时暂只能考虑修复小面积组织缺损,或者联合其他生物材料共同修复。较多文献报道PRF用于上颌窦提升和即刻种植周围骨缺损时,取得良好疗效,但对于单独使用PRF作为诱导骨组织再生充填材料,并二期植入种植体的报道尚缺乏。关于PRF新生诱导骨组织近期组织学观察较多,尚缺乏远期生物力学方面研究。因此,PRF的广泛应用,尤其在口腔种植这一学科,尚需深入的临床观察与实践。

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