尿液中膀胱癌肿瘤标记物的研究进展

曲知专 卓育敏

目前膀胱癌诊断及随访主要依靠尿细胞学检查与尿道膀胱镜检相结合的手段，然而侵入性的尿道膀胱镜检操作不便，给患者带来较大的痛苦，还有感染、出血等风险。因此，寻找可用于膀胱癌早期诊断及判断预后的无创指标非常重要，尿液是膀胱癌理想的肿瘤标记物来源。理想的膀胱肿瘤标记物应该具有的实验室特征：尿、血和肿瘤组织中存在并且其含量逐渐减少；不但精确预示肿瘤的存在，而且能够预示肿瘤的侵袭状态；标记物的水平须同疾病的严重程度相一致；检测方法具有高度的敏感性和特异性。临床潜在作用：筛选高危人群；对血尿和排尿刺激症状患者的检查评价；患者术后的监测。临床使用特点：检测结果的可重复性；收集标本方法简单实用；获取结果迅速，成本不高；检测方法简单，最好能在门诊进行。本文将近年来尿液中膀胱癌肿瘤标记物的研究进行了综述。

1 目前通过美国食品和药物管理局批准用于临床的膀胱癌相关的无创诊断方法

1.1 尿细胞学（cytology） 尿细胞学不属于肿瘤标记物范畴，作为膀胱肿瘤诊断金标准已多年，传统细胞学（conventional cytology，CC）的涂片质量不十分理想，从而影响到细胞学的诊断。尿脱落细胞学检测膀胱癌的敏感性为13%～75%，特异性为85%～100%，敏感性与肿瘤细胞分级密切相关。1996年FDA批准的液基细胞学检测（1iquid based cytology，LBC）技术，从根本上改变了传统涂片的制作方法，检测膀胱癌的敏感性为达90%以上，特异度方面与传统细胞学相当，对膀胱癌的诊断比传统细胞学更准确[1]。目前常见的几种液基细胞学检查技术有：新柏氏TCT技术、超柏氏LCT技术、利普液基细胞学LPT技术、国产液基细胞学技术如LBP。尿细胞学对诊断高分级的膀胱肿瘤具有较高的敏感度，但对低分级的则敏感度较差，且其结果易受操作者影响等缺点，寻找理想的尿液中肿瘤标记物弥补其缺点，甚至与其一同成为诊断金标准显得意义重大。

1.2 膀胱肿瘤抗原（bladder tumor antigen，BTA） 膀胱肿瘤抗原（bladder tumor antigen，BTA）又称人补体因子H相关蛋 白（human complement factor H related protein，HCFHrp）。肿瘤细胞分泌内源性基底蛋白与基底膜表面蛋白受体相结合，并释放蛋白水解酶破坏基底膜，基底膜碎片进入膀胱内聚成高分子复合物即BTA。BTA检测方法包括BTA、便携式免疫分析（BTA stat）和实验室ELISA（BTA TRAK）。其中早期的BTA方法是检测基底膜降解复合物，BTA stat和BTA TRAK是BTA的改进方法，可通过单克隆抗体的方法检测尿液中人类H相关蛋白补充因子，可在门诊快速得到定性和定量结果。BTA的有优点是其高敏感度，缺点是其高的假阳性率，尤其是当患者存在非癌性血尿或感染[2]。在2008年一项前瞻性多中心临床试验501位患者中，BTA统计监测报告的膀胱癌复发的敏感性（56%）大于细胞学检查（19.2%）的，特别是在1级病变（48%：13%），特异性仍不及细胞学（85.7%：98.3%）[3]。

1.3 核基质蛋白22（nuclear matrix protein 22，NMP22） 细胞核的成分之一，参与姊妹染色体的正确分离；肿瘤细胞在凋亡中释放出来。膀胱癌患者尿中NMP22水平是正常人的25倍。可以用多克隆抗体（NMP22 test）或免疫定量分析（NMP22 bladder check）检测尿液中NMP22水平监测膀胱癌复发，其在检测原发膀胱癌方面较差，Vinod Kumar Arora等[4]研究表明NMP22和细胞学检测膀胱肿瘤的敏感性分别为79%和65.8%，特异性分别为80%和100%。其在低级别的肿瘤中敏感性优于细胞学检查的。FDA已承认其在监测膀胱癌复发方面的作用。Hosseini等[5]研究表明NMP22检测和细胞学检测复发的敏感性分别为78.8%和44.2%，特异性分别为69.6%和83.7%。现很少单独应用，多与细胞学联合应用以提高癌检出率。

1.4 ImmunoCyt ImmunoCyt是一种结合了尿细胞学和荧光免疫细胞化学的独创技术，属于免疫细胞学检查，利用单抗19A211及抗体M344、LDQIO，通过免疫荧光显微镜去识别尿细胞表面的膀胱癌粘蛋白抗原（M344、LDQ10）和糖基化癌胚抗原的高分子量成分（19A211），其更普遍存在于低级别的表浅性膀胱癌中，具有较好的敏感性，较尿细胞学检查有明显优势。最近1个单中心研究ImmunoCyt显示其检测膀胱肿瘤的敏感性为73%，特异性为49%[6]。有研究显示ImmunoCyt在低级别肿瘤检测方面比无论是尿细胞学或FISH都更为敏感。特异性无明显差异[7]。但由于其高成本，对器械的要求及对检验医生水平要求较高也限制了其推广，目前它仅用于尿细胞学检测之外的辅助检测。

1.5 荧光原位杂交（FISH） FISH用于尿路上皮癌的诊断和术后监测，其灵敏度及特异度是现今尿液肿瘤标志物检查方法中最高的一种。且其检测结果不受卡介苗（BCG）治疗的影响，可用于BCG膀胱灌注治疗的监测。但由于FISH法的工作量大且费用高，因此在临床应用受到限制。2008年Hajdinjak[8]对14项研究共2477次的FISH检测结果进行Meta分析得出结论：fish诊断尿路上皮癌总的敏感性为72%，特异性83%，而尿脱落细胞学检查的敏感性及特异性分别为42%及96%尤其对于低分级低分期肿瘤，fish检测膀胱癌的敏感度要远高于尿脱落细胞学检查，将Ta期肿瘤去除后再进行分析，fish诊断膀胱癌的敏感度仍然高于尿脱落细胞学检查，分别为86%及61%。国内虽有研究显示我国膀胱癌患者的染色体号和畸变发生率与国外报道间存在显著差异[9]。但近年来的国内相关研究也都表明FISH的敏感度和特异性在国人膀胱癌的诊断上亦是理想的一种。随访过程中当FISH检查再次出现阳性时，则可认定是膀胱癌复发。FISH还可以作为尿细胞学或ImmunoCyt的一个确证试验[7]。FISH检查有望和细胞学一同成为诊断膀胱肿瘤金标准。

2 处于研究阶段的膀胱癌肿瘤标志物

2.1 膀胱特异性核基质蛋白（BLCA） 1996年，Getzenberg等[10]对17例膀胱癌组织和正常组织研究首次分离确定了9种膀胱核基质蛋白，其中6种只在膀胱癌组织中表达而在正常膀胱人膀胱组织中缺乏，这6种核基质蛋白命名BLCA1、2、3、4、5、6；另外3种只存在于正常人的膀胱组织中，命名为BLNL-1、2、3。对膀胱癌细胞系253j、T24和UMUC-2研究中发现6种BLCA的5种（BLCA-1、2、3、4、6）存在于3种癌细胞系中，BLNL1-BLNL3未发现存在于癌细胞系中，此组蛋白在膀胱癌转化与形成中的相互联系和作用尚不清楚，检测BLCA-4的抗体多为抗人BLCA-4多克隆抗体，更加特异的单克隆抗体正在研究将使检测结果更加准确；同时还需进行大量病例的研究，建立更高的正常临界值，以提高其特异性，而不降低敏感性。国内有人制备了BLCA-4单克隆抗体并检测15例膀胱癌标本，其敏感度和特异度分别为93.3%和100%[11]，最近一项研究表明BLCA-4高表达的膀胱癌患者预后差[12]。BLCA族其他成员在检测膀胱癌中的价值也尚处于基础阶段。

2.2 透明质酸及透明质酸酶 HA为一种葡萄糖氨基聚糖，是真核细胞胞外基质和体液的基本成分。在肿瘤组织，升高的HA大部分集中在肿瘤基质中。HAase是一种降解HA的内生性糖苷酶，能促进肿瘤侵袭。目前发现有三种HAase基因，诱导膀胱癌的类型是HYALI型；多元统计分析则表明[13]，HYALI检测肿瘤的肌层浸润准确率为76.8%，肿瘤复发准确率为67.8%，在预测肿瘤肌层侵犯和转移方面，是一个很有潜力的能独立预测预后的标记物。

2.3 细胞角蛋白（eytokeratins，CK） 细胞角蛋白（eytokeratins，CK）是上皮细胞中间丝的组成成分，表达水平依赖于上皮类型、分化及恶性程度，也是一种常用的肿瘤免疫组织化学标记物，阳性表达见于上皮细胞、间皮细胞；癌，间皮瘤等。上皮组织存在20种不同的CK，几乎所有上皮细胞在恶性转化过程中均维持其表达量，因而是上皮来源肿瘤细胞的一种特征性变化。与膀胱癌相关的有CK8、CKl8、CKl9和CK20。应用酶联免疫吸附试验（UBC Ⅱ ELISA）测量尿液中的细胞角蛋白8和18对膀胱原位癌的诊断有一定意义，尤其是对膀胱原位癌，但其对膀胱肿瘤总的敏感性及特异性低[14]。CYFRA21-l是CKl9的可溶性片段，通过识别2株单克隆抗体BMl9-21和KSl9-l的双抗体夹心法进行测定，对Gl期膀胱癌的敏感性较好。CK20并不是一个真的可溶性标记物，它需要对脱落细胞采用RT-PCR进行处理，检测复杂、昂贵，在许多非恶性疾病甚至健康人群中也会增高，总之现今CK的检测方法均不如尿脱落细胞学检查，限制其发展和应用。

2.4 微卫星（Microsatelite MS） 微卫星是广泛存在于原核及真核细胞基因组中高多形性短阵串联的DNA重复序列（每对大概24个碱基）。目前在许多肿瘤中都发现了微卫星异常，包括杂合性缺失和微卫星不稳定性（体细胞微卫星位点的扩增、丢失和缺失），有学者发现国内膀胱癌患者微卫星异常较集中于 D18S46、IFNA、D85S137、D16S47 6等位点[15]，检出率约为80%，与国外报道显著不同。由于MS数目庞大，分布较广，敏感性和特异性受选择的位点及其组合的影响，而位点及其组合的筛选需考虑种族、地域的影响，因此如何选择恰当的位点，值得深入研究。

2.5 纤维连接蛋白（fibronectin，Fn） FN是一种大分子非胶原糖蛋白，在泌尿系统它只存在于尿路上皮的基底膜及黏膜下层。膀胱癌中基底膜FN均有不同程度的丧失，肿瘤侵犯基底膜以及诱导产生的蛋白酶增加了FN从基底膜中的释放，而使尿中FN的含量上升。国内有学者首先报道用尿FN诊断膀胱癌[16]，近年来也已自主研究出一种FN试纸，可作为人群的筛检和门诊的初诊手段，现已致力于FN试纸的临床研究，正努力获得国内的认可和批准。

2.6 存活素（survivin） 与抑制细胞凋亡细胞周期调控肿瘤血管形成肿瘤细胞耐药等有关，是一个具有潜在价值的肿瘤标志物，与肿瘤的预后也密切相关。Survivin基因在胎儿的发育过程中有表达，成人健康组织中检测不到，但许多肿瘤中丰富表达。Survivin能在膀胱癌尿液中检测到，并与其复发、分期、预后和死亡率相关。利用RT-PCR技术检测尿液中Survivin的mRNA，可用于筛选血尿患者，但诊断的稳定性需大量的样本来验证。

2.7 成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3） 很多生长因子在文献晕都有报道，如表皮生长因子受体、血管上皮生长因子、肿瘤坏死因子、纤维母细胞生长因子受体3（FGFR3）等。van Oers等[16]在一项280人的病例研究中发现FGFR3的变异率在膀胱癌和上尿道肿瘤的发生率相当，并且与低度恶性肿瘤相关。约50%的早期膀胱肿瘤中存在FGFR3突变，存在该突变的肿瘤患者多预后较好。

2.8 DNA甲基化 DNA甲基化肿瘤相关基因启动子CpG岛甲基化状态异常广泛见于肿瘤，有望作为临床肿瘤诊断的分子标记。并与肿瘤浸润发展、患者预后及总的生存率相关[17]。

2.9 其他 p53基因、癌胚抗原（carcinoma embryonic antigen，CEA）、端粒酶（Telomerase）、尿脱落细胞Lewis X抗原检测、纤维蛋白原降解产物（FDP）、基质金属蛋白酶（MMP）、尿激酶纤溶酶原激活物（Urinary urokinase-type plasminogen activator，uPA）、粘蛋白7（Mucin 7）、微小染色体维持蛋白5（minichromosome maintenance proteins 5，MCM5）、Upk3a、细胞分裂周期蛋白基因6（cell division cycle 6，CDC6）等均有待进一步研究及验证。

3 结论、存在问题及展望

许多肿瘤标志物检测方法的敏感度尤其在低级别肿瘤检测方面高于尿细胞学检测的，可弥补其不足，但多有特异性低、需要进行标准化前瞻性的多中心研究以验证其可行性、缺乏标准化和可重复性差等不足。BTA、FISH检查在检测低级别肿瘤较尿脱落细胞学更有优势。NMP22适用于膀胱癌术后复发的监测，单独使用易误诊。FISH有望和尿细胞学一同成为膀胱癌诊断金标准，尤其在原位癌及pTa期膀胱癌。现仍没有发现可用于检测癌前病变的标记物，期望不久的将来，各种标志物试纸的出现会使膀胱癌的检测更为无创、方便、快捷。

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