心脏干细胞基础研究和临床应用回顾与展望

段茂林 综述，廖 斌 审校

CSCs对心脏干细胞（CardiacStemCells，CSCs）的发现打破了传统对心脏是“终分化不可再生”器官的认识。经过大量实验研究，目前已经对CSCs 有了初步的认识，包括CSCs 的形态特征，迁移性，具有代表性的细胞标记物，以及CSCs的分化潜能。心脏，从来都被认为是一个终分化的器官，临床上一些疾病，例如心肌梗死、心力衰竭、扩张性心肌病、病窦综合症等造成的心肌损伤都是不可逆的，临床治疗中仍不能找到有效的方法“获取”新的心肌来代替受损的心肌。2002年Hierlihy1等从小鼠心肌细胞中分离出一类具有干细胞生物行为特征的细胞，命名曰“边缘细胞群”（SidePopulation,SP），这类细胞有向心肌细胞分化的潜能，证明了心脏并不是一个终分化的器官，心脏仍然具有再生能力。CSCs 越来越多的研究，不断支持CSCs 存在于心脏的结论，并且证明了其具有自我增殖和分化成心脏各种细胞成分的潜能，CSCs 逐渐走进了人们的视野，成为组织再生工程研究的热点对象。

1 CSCs的分类

CSCs 被证明存在以来，就一直成为干细胞研究的热点对象。已经认识到CSCs并非是一类单一特性的干细胞，而是一群处于不同分化阶段、并具有向心脏各类细胞（心肌细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞等）分化潜能的谱系细胞群体2,3。CSCs位于心脏干细胞巢（CardiacStemCellsniches）中，处于多向分化程度，并通过结构和功能蛋白与其周围的支持细胞（surpportingcells）相连接2,3，因此，真正意义的CSCs应该叫做心脏干细胞谱系（cardiacstem cellsculture）。通过寻找CSCs的特有细胞表面标记物来区分它们，是目前最通用、最有效也是最具有可行性的方法。对于CSCs 的不断研究使人们发现，很多存在于其他类型干细胞表面的标记物也出现在CSCs 表面，因此借用这些细胞表面标记物可以使CSCs得以初步筛分，但由于这一系列标记物并非CSCs所特有，而且分离和纯化CSCs也缺乏有效方法，这种方法对CSCs的分类是否有意义，尚需进一步验证。目前，人们在CSCs 表面发现的干细胞标记物有C-kit，MDR,Sca-1,Islt-1以及一些比较特殊的CSCs团体结构。

1.1 C-kit+CSCs C-kit，干细胞因子，在许多成体干细胞都有表达。C-kit 是目前研究得最彻底的CSCs标记物。2003年，Antonio4等利用流式细胞仪首次从小鼠心脏中分离出了Lin-C-kit+细胞，证明了这类细胞具有克隆、自我更新以及多能分化潜能，也通过荧光染色的方法证明了这类细胞可以产生心脏结构谱系标记物，如GATA-4、Nkx-2.5、MEF2C，同时指出C-kit并不表达于造血细胞系；2010年，HeJQ5等指出，C-kit最先出现在造血谱系细胞，但在造血细胞分化时消失；2005年Konrad6等在对急性心肌梗死病人及慢性缺血性心脏病病人的研究中发现，在急性心肌梗死模型中，梗死区有一群“快速反应”的CSCs，它们可以分化出心肌细胞、平滑肌细胞，源于冠脉的干细胞可以分化出内皮细胞，并且这些CSCs 中约60%是C-kit+-MDR+-Sca-1+谱系细胞，单纯表达C-kit+的CSCs 占12%左右，而慢性缺血性心脏病CSCs 的生长却很不明显；近来的实验也已证明，体外已经成功培养出可以稳定表达C-kit 的人CSCs5。以上证据充分表明，如果可以在体外培养出这样的干细胞、保持其分化增殖能力，并将其移植回心肌梗塞患者心脏内，使其增殖分化出新的心肌细胞来替代受损的心肌，对于恢复患者心功能有可能会有效。

1.2 MDR+CSCs MDR（multi-drug resistance）多耐药。在各种人体组织都有发现，其特点是能够排出代谢性标记物如烟酸己可碱333427，这个特性需要依赖P-糖蛋白或转运蛋白的表达，如ABCG28,而P-糖蛋白或转运蛋白则是MDR 基因编码产生9。MDR+CSCs是一种特殊类型的CSCs，有实验1,10在成人心肌中分离出了侧群细胞（side populationcell，SPcell），并且证明了这类细胞可以表达MDR 基因，产生ABCG2,而Oyama10 的实验证明，表达ABCG2 的SP细胞在心肌中可以分化出心肌细胞，成纤维细胞等，这也证明了SP细胞具有再生能力，但是SP细胞在心脏中含量很低，其对心肌的修复能力效果还有待研究。

1.3 Sca-1+CSCs Sca-1 干细胞抗原1，属于Ly-6 家族成员之一，最早是以造血干细胞谱系表面抗原被报道11，2004 年Matsuura12 等通过磁珠分离法从成年鼠心脏中分离出Sca-1+CSCs，它们缺乏造血细胞系干细胞的表面特征标记物，他们将分离出的Sca-1+CSCs于体外培养，催产素刺激2 周后，培养出可搏动心肌细胞，并检测到这些细胞可以表达一系列产生心肌结构蛋白的基因，比如GATA-4，MEF2C等；2012年，Ye-JQ13 等在急性心肌梗死小鼠动物模型的研究中发现，急性心梗后2 周，梗死区产生了许多具有干细胞行为特性的细胞，多为Sca-1+-CD45-亚群细胞，这些细胞可以分化成成纤维细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，并且证明了这些细胞是心源性细胞，而非源自骨髓干细胞。

1.4 Islt-1+CSCs Islt 胰岛因子，在胚胎和出生后的胎儿，我们都能发现Islt-1+CSCs 的存在，并且相关的研究发现，Islt-1+CSC 似乎对于心脏及大血管的正常发育有重要作用。2003年L.C Chen14等描述了关于Islt-1+CSCs的特征和其对心脏发育的重要性，他们指出Islt-1+CSCs源自第二生心区，参与构成流出道、右心室、右心房及少部分左心室。同时，Islt-1+CSCs 的表达还调控Bmp415 和Wnt 信号通路,这些信号通路的开启会激活GATA4 和SRF（Serum response factor，血清反应因子）的表达16。

1.5 心外膜干细胞（Epicardium-derived cells,EPDCs）CSCs的另一个来源是心脏外膜，有多组报道指出成人心脏外膜存在内源性的心外膜干细胞，可以衍生出心肌和血管平滑肌17，并且EPDCs 还有诱导产生外膜纤维细胞、冠脉平滑肌细胞及内皮细胞的潜能18,19,20。Madonna 等实验证明，人EPDCs 注射到有免疫缺陷的小鼠模型心肌，可以提高小鼠心脏EF值，并防止心肌的纤维性重塑21。

1.6 几种特殊的CSCs形态

1.6.1 心肌球样细胞群（cardiospheres）2004 年Elisa Messina22等从心肌中分离出一种特殊的具有干细胞特性的细胞群，他们称之为球体样细胞（Sphere-Forming Cells），通过免疫检测，他们发现心肌球样细胞群表达许多内皮细胞表面标记物KDR，flk-1，CD-31及干细胞表面标记物C-kit，Sca-1，并且证明了这类细胞可以向内皮细胞及心肌细胞分化。

1.6.2 侧群细胞 Hierlihy1 等首先从小鼠心肌细胞中分离出一类具有干细胞生物行为特征的细胞，将其命名为边缘群细胞或者侧群细胞（SidePopulation,SP），和新生心肌共培养可以诱导SP 细胞向心肌细胞分化。2002年，Kazumasa等对心脏SP细胞做了较为详细的阐述23：他们指出心脏SP细胞通常表达Sca1而不表达造血细胞系的相关细胞标记物，如CD34 和CD45。Oyama10 等首次描述了在体的SP 细胞的特性，GFP+新生SP可以向受损的心肌细胞迁移，增殖和分化成新生心肌细胞，修复受损的心肌细胞。与Oyama 研究相类似，Yew Liang24 的研究显示，Sca+-CD31 SP 细胞在体外可以可以向心肌细胞和内皮细胞分化和增殖，并且，当心肌细胞受损时，Sca+-CD31 SP细胞可以向受损细胞迁移，并且有成血管作用。

目前对CSCs的认识仍然有限，因此对于CSCs的分类还比较混乱，没有统一的分类方法，有研究指出了以上几种不同细胞表面标记物的CSCs之间有着很紧密的联系，Konrad6 的研究表明，急性心梗的病人心肌中可以见到新生的CSCs，其中60%细胞C-kit、MDR、Sca-1 同时表达，而只有很少部分只表达单一一种或两种表面标记物，同时，有证据显示25,26上述的某些CSCs 可能只是同一种干细胞的不同亚群，因此表面抗原区分CSCs 的方法虽然是目前分类CSCs的通用方法，但是其可靠性需要进一步论证。

2 离子通道与CSCs

目前，离子通道对于干细胞的影响研究多集中在人类胚胎干细胞（human embryonic stem cells，HESCs）对象，而非CSCs，少数研究者有过对CSCs的研究，Yi H,27 等在对免疫磁珠方法分离出的小鼠Ckit+细胞离子通道研究中观察到了三种类型的膜电流：延迟整流钾电流（IKDR）、内向整流钾电流（IKir）、容积依赖性氯离子ICl vol，他们指出，离子通道的表达存在异质性，这说明可能处于不同时期的细胞离子通道的表达不一致28。离子通道对CSCs 的作用还不是很清楚，研究也不多，还有比较大的研究空间29。

3 CSCs的临床应用与展望

虽然对于CSCs 的认识还存在很多不确定和模糊，但应该得到肯定的是CSCs 的临床应用前景。在治疗急性心肌梗死和缺血性心肌病中，CSCs 具有巨大的潜力，美国心脏病协会（AHA）2012 科学会议上公布的缺血性心肌病患者心肌干细胞（CSC）注射小型研究“缺血性心肌病患者干细胞注射”（SCIPIO）试验的2 年随访结果显示，2 年内，接受“CSCs”注射的治疗组LVEF 都有明显提高，说明CSCs 对于恢复心脏的泵功能确实有效,CSCs 无论在心肌梗死后心肌再生及心功能恢复或者是构建生物起搏器方面都有其不可替代的优势，有巨大的研究前景和研究价值。虽然CSCs已经被发现多年，但目前人们对于CSCs的认识仍然较少，有很多甚至是空白，比如将骨髓间充质干细胞移植回心脏后，有导致心律失常的报道，CSCs 移植回心脏会不会也有导致心律失常的表现，如何保证CSCs不向肿瘤细胞分化，诱导CSCs培养出的起搏样细胞是否有时效性，除此之外，值得重点关注的是，新近对于microRNA 的深入研究发现，miRNA 在调控心脏发育方面也起着关键性的作用，尤其在心血管谱系细胞的分化中有很重要的作用，比如miRNA290-295 谱系被认为参与了促进ESC 增殖、及干细胞的分化多能性维持的调控30,31；miRNA-302-367谱系通过调节细胞周期来维持ESC的增殖32；有报道指出miR134,miR-296 和miR470 在ESC 分化时处于上调状态33，miRNA-145 不仅直接靶向抑制多能性因子Oct4,Sox2,and Klf4,还通过其过表达抑制ESC 自我更新，促进不同谱系种类细胞形成34,SK4Ca+激活K+通道对于HESCs向心脏起搏细胞分化具有重要作用35，但是这些都是基于对ESC的研究，CSCs 是否有类似的效果还不得而知，因此这方面的研究空间和可研究性还很大。

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