三聚氰胺在水生生物体内转化规律的研究

樊银明，马晓国

(广东工业大学环境科学与工程学院，广东广州510006)

三聚氰胺(Melamine)简称三胺，有3种同系物，分别是三聚氰酸(Cyanuric acid)、三聚氰酸一酰胺(Ammelide)、三聚氰酸二酰胺(Ammeline)。目前研究表明［1-2］，三聚氰胺在机体内的代谢属于不活泼代谢，即在机体内不会迅速发生代谢变化，只会以原体形式或同系物形式排出，而不是代谢产物形式。三聚氰胺经三步脱氨基作用可逐步水解为三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸［3］。近年来，利用微宇宙系统研究化学物质在环境中的迁移与归宿，得到越来越广泛的应用［4-8］。微宇宙是依据自然环境原型设计，通过建立生态模型来研究化学物质的迁移、转化从而了解其在环境中的迁移与归宿。

该研究利用微宇宙模拟水生态系统，以罗非鱼、田螺为试验动物，采用室内静水养殖，对三聚氰胺在模拟养殖水体中的生物体内的转化规律进行了初步研究，旨在为三聚氰胺在生物体内的代谢转化过程提供一些科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计 试验采用室内静水养殖系统，在聚乙烯水族箱(50 cm×50 cm×50 cm)中进行，放入约10 kg不含三聚氰胺的干净土壤，加入已曝气24 h的自来水约100 L。缸内放养大小匀称、体质健康、平均体重在80～100 g的罗非鱼20尾(雌雄约各占一半);田螺60只;金鱼藻200 g。采用自然光照，控制水温(25±2)℃，pH在7.0±0.2，溶解氧5 mg/L以上，持续充氧，定时投喂明珠牌(珠江水产研究所饲料厂)鱼饲料。所有生物试养10 d，保证系统稳定后，采用水体输入的方式，称取5.0 g三聚氰胺(化学纯)，用超纯水溶解，加入试验水族箱中并混匀，使水中三聚氰胺浓度为0.05 g/L。每组试验设置3个平行加标试验水族箱，3个空白对照。分别于第1、2、4、7、10、15、20 天从 3 个加标试验水族箱中各采集罗非鱼2尾，田螺6只，经处理后将各类样品分别混匀，其中罗非鱼去磷，去皮，去鱼刺，分别取鱼肉、肾脏、肝脏及其他内脏部分捣碎;田螺去壳后分别取螺肉及内脏部分捣碎收集样品。所取生物样品一个月内完成分析。同时从空白试验水族箱中各取3个平行样，采集及制样方法与加标样一致。

1.2 仪器与试剂 7890A-5975C气相色谱-质谱仪(美国Agilent公司);MAS-Ⅱ常压微波辅助合成仪(上海新仪微波化学科技有限公司);KQ-100DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);KDC-140HR高速冷冻离心机(安徽中科中佳仪器有限公司);Smart2Pure超纯水系统(电导率0.055 μS/cm德国TKA公司);上海安亭250 μl微量进样器(上海安亭微量进样器厂);N-EVAP112氮吹仪(美国Organomation公司);XW-80A旋涡混合仪(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司);AUW320电子分析天平(岛津企业管理(中国)有限公司);JPB-607A便携式溶解氧测定仪(上海精密科学仪器有限公司);PHS-3C型pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)。混合型阳离子交换固相萃取柱(60 mg，3 ml，德国CNW Technologies GmbH)。

N，O-双三甲基-硅基三氟乙酰胺(BSTFA)+1%三甲基氯硅烷(TMCS)(美国Regis Technologies，Inc);三聚氰胺纯品99.9%，上海阿拉丁试剂;三聚氰胺化学纯99%，上海阿拉丁试剂;三聚氰酸标准品，纯度为99.0%(德国Dr.Ehrenstorfer);三聚氰酸一酰胺标准品，纯度为99.0%(德国Dr.Ehrenstorfer);三聚氰酸二酰胺标准品，纯度为98.0%(德国Dr.Ehrenstorfer);吡啶、甲醇均为色谱纯(德国CNW Technologies GmbH);二氯甲烷、三氯乙酸均为分析纯，上海阿拉丁试剂。

1.3 样品预处理 水样经0.22 μm滤膜过滤，取5 ml于50℃下氮气吹干，加入300 μl吡啶、150 μl衍生化试剂，涡旋混合1 min，用玻璃磨口塞密封，微波功率420 W下反应1 min，冷却转移至样品瓶中，供气相色谱-质谱测定。其他生物样品经自然解冻后，用甲醇超声提取，离心后取上清液过固相萃取柱，收集洗脱液氮气吹干后进行衍生化，冷却后转移至样品瓶中，供气相色谱-质谱测定［9］。

1.4 分析与测定方法 气相色谱-质谱仪(7890A-5975C)，HP-5MS毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);进样口温度250℃;电子轰击离子源(EI);电离能量70 eV;离子源温度230℃;四极杆温度150℃;传输线温度280℃;程序升温:70℃下保持1 min，以20℃/min升至200℃保持5 min，再以30℃/min升至280℃;不分流进样，进样量1.0 μl;载气为高纯氦气，流速1.0 ml/min。全扫描Scan/选择离子监测SIM扫描模式，三聚氰胺及其同系物的保留时间和质谱条件如表1所示。

表1 三聚氰胺及其同系物的保留时间和质谱条件

所有结果的获得都是利用已知三聚氰胺及其同系物标样对样品中各峰进行外标定性［10-17］。

2 结果与分析

采用GC-MS，利用已知三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺、三聚氰胺标准品对样品中各峰进行外标定性研究发现，三聚氰胺进入水体后，能被水生生物迅速吸收。试验第1天，水生生物体内就能检测出三聚氰胺。其中，鱼其他内脏(除肾脏和肝脏)在试验15 d、20 d时测出含有三聚氰酸二酰胺，鱼肾脏和肝脏在试验20 d时测出含有三聚氰酸一酰胺(图1、图2)，这可能是因为三聚氰胺先在鱼其他内脏内进行第一步脱氨基作用水解成三聚氰酸二酰胺，水解得到的三聚氰酸二酰胺进入肝脏和肾脏，进一步脱氨基水解成三聚氰酸一酰胺。螺肉和螺内脏在20 d时分别测出含有三聚氰酸二酰胺和三聚氰酸一酰胺(图3、图4)。水样在试验15 d、20 d时分别测出含有三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸，可能是来自于鱼或田螺将体内的三聚氰胺转化成其同系物的形式排出体外，而螺和鱼体内没有测出三聚氰酸，这可能是因为三聚氰酸在生物机体内为惰性代谢，容易被机体排出体外，而且三聚氰酸是三聚氰胺三步脱氨基作用的最后水解产物，其含量低，导致三聚氰酸在机体内基本上不残留。

3 结论

图1 鱼肾脏20 d的SIM

图2 鱼肝脏20 d的SIM

图3 螺肉20 d的SIM

图4 螺内脏20 d的SIM

试验利用微宇宙水族系统，初步研究了三聚氰胺在水生生物体内的转化规律。三聚氰胺进入水体后，能被水生生物迅速吸收。在试验初期水生生物体内的三聚氰胺以原体的形式排出体外，在试验后期一部分三聚氰胺经脱氨基作用逐步水解为三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸，以其原体和同系物的形式排出体外。试验结果为研究三聚氰胺在水生生物体内的转化规律提供了资料，但三聚氰胺在机体内的脱氨基转化机理有待进一步试验研究。

［1］邵静君，温家琪，徐世文.三聚氰胺毒理学研究进展［J］.现代畜牧兽医，2007(12):52-54.

［2］尹荣焕，刘娇，王心竹，等.三聚氰胺及其同系物的毒理学研究进展［J］.动物医学进展，2012，33(9):100-105.

［3］高春起，张海军，武书庚，等.三聚氰胺的毒性及其在畜产品中残留规律的研究进展［J］.动物营养学报，2011，23(2):187-195.

［4］刘福光，刘毅华，赵颖，等.毒死蜱对南方稻区水域生态效应的室内微宇宙模拟研究［J］.农药学学报，2013，15(2):198-203.

［5］毕相东，张树林，张波，等.微宇宙法分析小檗碱对模拟池塘生态系统的影响［J］.南开大学学报:自然科学版，2012，45(5):58-64.

［6］李明堂，郝林琳，崔俊涛，等.微宇宙系统中氯苯的生物强化处理［J］.环境科学学报，2010，30(3):600-605.

［7］吕晓磊，马放，王立，等.水源地水体富营养化过程微宇宙模拟实验研究［J］.环境科学与技术，2010，33(12F):22-27.

［8］吴颖慧，蔡磊明，王捷，等.莠去津对标准化水生微宇宙的影响［J］.农药学学报，2008，10(3):343-348.

［9］张燕萍，马晓国，樊银明.污染水体中鱼体内三聚氰胺的累积及其在清洁水体中的消除［J］.生态环境学报，2013，22(8):1414-1417.

［10］刘永涛，杨红，艾晓辉.高效液相色谱法检测水产品中三聚氰胺的残留量［J］.分析试验室，2009，28(zl):138-141.

［11］覃东立，战培荣，陈中祥，等.反相高效液相色法测定水产品中三聚氰胺［J］.分析试验室，2009，28(9):116-118.

［12］王征.GC-MS法测定动物食品中的三聚氰胺［J］.福建分析测试，2008，17(2):1-4.

［13］晨阳，范倩，林德清，等.气质联用法测定饲料中的三聚氰胺［J］.饲料工业，2008，29(8):48-50.

［14］MIAO H，FAN S，WU Y N，et al.Simultaneous determination of melamine，ammelide，ammeline，and cyanuric acid in milk and milk products by gas chromatography-tandem mass spectrometry［J］.Biomedical and Environmental Sciences，2009，22(2):87-94.

［15］MÑIZ-VALENCIA R，CEBALLOS M S，ROSALES M D，et al.Method development and validation for melamine and its derivatives in rice concentrates by liquid chromatography.Application to animal feed samples［J］.Anal Bioanal Chem，2008，392(3):523-531.

［16］朱聪英，应永飞，罗江成，等.GC-MS法同时测定生鲜乳中三聚氰胺及其类似物的研究［J］.中国饲料，2011(22):27-31.

［17］XIA J G，ZHOU N Y，ZHOU C，et al.Simultaneous determination of melamine and related compounds by hydrophilic interaction liquid chromatography electrospray mass spectrometry［J］.J Sep Sci，2010，33(17):2688-2697.