镁离子对大鼠血管平滑肌细胞钙化的影响*

白亚玲 徐金升 冯伟勋 张俊霞 崔立文 张慧然 张胜雷

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）在我 国的患病率高达10.8%[1]，心血管疾病（cardiovascu⁃ lar disease，CVD）是CKD患者主要的并发症之一，并且呈逐年进展的趋势。近年来研究发现血管钙化在CKD患者中非常普遍，亦是CVD发生的独立危险因素[2]。Kanbay等[3]研究发现40%～70%的透析患者可发生冠状动脉钙化，且CKD患者比一般人群更容易发生血管钙化。现大多数学者普遍认为CKD患者的血管钙化发病的中心环节为血管平滑肌细胞向成骨/成软骨样表型转化[4]，而磷在其中起着关键性的作用，同时还包含许多其他复杂因素，但具体机制还未完全阐明，对血管钙化也缺乏行之有效的治疗手段。有研究显示镁可能作为磷的结合剂，降低血磷水平，从而抑制血管钙化[5]。本研究旨在探讨增加镁离子的浓度是否对血管钙化有影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 兔抗鼠平滑肌肌动蛋白单克隆抗体购自北京博奥森生物有限公司，酶标仪（HT2型）购自奥地利Anthos公司，倒置相差显微镜（LH50A型，OLYMPUS），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Hyclone公司，DMEM培养基购自美国GIBCO公司，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）免疫组化试剂盒购自上海博海生物工程，二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒购自中山金桥股份有限公司，噻唑蓝（MTT）试剂购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 原代培养获取大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs），进行形态学及免疫细胞鉴定，后采用完全随机法将VSMCs分为阴性对照组、高磷组、镁干预组。阴性对照组采用含10%胎牛血清培养，高磷组采用高磷培养基（含10 mmol/L β－甘油磷酸）培养，镁干预组在高磷培养基的基础上分别加入不同浓度的氯化镁，使镁离子的终浓度分别为1 mmol/L（镁干预组1）、2 mmol/L（镁干预组2）和3 mmol/L（镁干预组3），共刺激7 d。

1.2.2 细胞鉴定 参照文献[2]进行细胞鉴定。形态学观察：应用倒置相差显微镜观察细胞大小、形态、生长特点及排列方式等。免疫细胞化学染色：6孔板内用消毒的盖玻片制作细胞爬片，待细胞贴壁生长至60%～70%时，弃去培养基，用免疫细胞化学方法鉴定平滑肌细胞特异性抗体a-SMA ac⁃tin。DAB显色，苏木素轻度复染，经分化，脱水，透明，封片，在显微镜下观察。

1.2.3 钙化检测 （1）茜素红染色[6-7]：取生长至4～5代的细胞以5×104个/孔密度接种于6孔板内，刺激7 d，茜素红进行钙化染色，倒置显微镜下观察照相。钙盐沉积为橘红色。（2）细胞内钙含量测定[8]：取4～5代细胞以2×105/孔密度接种于6孔板，干预7 d，细胞用盐酸脱钙取上清，钙定量检测试剂盒测定钙含量，脱钙后的细胞用0.1 mol/L NaOH和0.1%的十二烷基硫酸钠（SDS）溶解30 min，二辛可酸（BCA）法测定细胞蛋白含量，结果用细胞钙含量比蛋白含量表示（μg/mg蛋白）。实验每组设3个复孔。（3）碱性磷酸酶（ALP）活性测定[7]：取4～5代细胞以2×105个/孔密度接种于6孔板，干预7 d，弃去培养液，用PBS洗涤细胞3次，每孔加入500 μL 0.1% Triton X-100置4℃环境中约12～24 h，然后反复吹打裂解细胞后置于离心管中离心，按化学发光法检测ALP活性。

1.2.4 反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测细胞内核心结合因子α1（Cbfα1）mRNA的表达 细胞总RNA提取采用Trizol一步法。引物序列由primer 5.0软件设计。Cbfα1上游引物5′-CCGCACGACAACCGCACCAT-3′，下游引物5′-CGCTCC⁃GGCCCACAAATCTC-3′；GAPDH上游引物5′-CAAGGT⁃CATCCATGACAACTTTG-3′，下游引 物 5′-GTCCAC⁃CACCCTGTTGCTGTAG-3′。实验重复3次，以GAPDH作为内对照，计算相对含量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，2组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较行SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VSMCs原代培养 大鼠胸主动脉组织块贴壁3～4 d后可见细胞从组织块边缘爬出，细胞为长梭形，呈束状排列，5～6 d成同心圆状细胞团，形成明显的细胞生长晕，并围绕组织块边缘呈束状向外呈放射状延伸，约6～7 d后融合成片，细胞可达亚融合状态，呈接触抑制状态，此时可传代。细胞传代后，未贴壁时细胞呈椭圆形，不透明，4～6 h后开始贴壁，贴壁后的细胞逐渐伸展，星形或不规则形，以梭形为主，细胞核呈卵圆形，透明度增加，相互重叠生长，呈典型的“峰-谷”样表现，见图1。

Figure 1 Primary culture of VSMCs(×100)图1 VSMCs原代培养(×100)

2.2 VSMCs细胞鉴定 HE染色及瑞氏-姬姆萨染色可见细胞呈梭形，胞浆丰富，核大而圆或椭圆。免疫细胞化学染色可见细胞胞浆表达强阳性，免疫反应产物呈棕黄色，见图2。传代纯化，细胞生长特性未见异常改变。

2.3 钙化检测

2.3.1 茜素红染色结果 与阴性对照组比较，高磷组及镁干预组的VSMCs钙化染色均加重。与高磷组比较，镁干预组随着镁离子浓度增大钙化结节染色逐渐降低，镁干预组2开始出现钙化结节缩小，并呈一定浓度依赖性，镁干预组3钙化结节达最小，见图3。

Figure 2 The identification of VSMCs图2VSMCs细胞鉴定

Figure 3 Alizarin red staining of VSMCs（×100）图3 茜素红染色（×100）

2.3.2 不同浓度镁离子对VSMCs中钙含量的影响 与阴性对照组相比，高磷组及镁干预组刺激VSMCs后，钙含量均显著增加。镁干预组随着镁离子浓度增大钙含量逐渐降低，除镁干预组1与高磷组差异无统计学意义外，镁干预组2和镁干预组3均低于高磷组（均P＜0.05），见图4。

2.3.3 不同浓度镁离子对VSMCs ALP的影响 除镁干预组3 VSMCs ALP水平与阴性对照组差异无统计学意义外，其余组均高于阴性对照组（均P＜0.05）。镁干预组随镁离子浓度增大ALP活性逐渐降低，且均低于高磷组（均P＜0.05），见图5。

Figure 4 Comparison of the calcium content between different groups图4 各组VSMCs钙含量的比较

Figure 5 Comparison of ALP levels between different groups图5 各组VSMCs ALP水平的比较

2.4 不同浓度镁离子对VSMCs中Cbfα1 mRNA表达的影响 见图6。除镁干预组3 VSMCs中Cbfα1 mRNA的表达与阴性对照组差异无统计学意义外，其余组均高于阴性对照组（均P＜0.05）。镁干预组随着镁离子浓度增大Cbfα1 mRNA的表达水平逐渐降低，且均明显低于高磷组（均P＜0.05）。

Figure 6 Expressions of Cbfa1 in VSMCs detected by RT-PCR图6RT-PCR检测VSMCs中Cbfα1的表达

3 讨论

近年研究发现CKD患者的低镁血症与血管钙化和CVD死亡率相关[3]，而血管钙化又是心血管疾病的重要环节。在CKD患者中血管钙化有其特殊性，主要表现为中膜钙化，位于血管中膜的VSMCs在CKD患者血管钙化中起着关键作用[9]。Ishimura等[10]研究发现血清镁在一定范围内与血管钙化负相关，血镁浓度与透析患者生存率呈正相关。

VSMCs的成骨样表型转化是血管钙化的结构基础，本研究通过使用含有10 mmol/L β－甘油磷酸钠的培养基诱导大鼠VSMCs发生成骨样转分化和钙化。茜素红矿化结节染色发现，高磷组及镁干预组VSMCs钙化染色较阴性对照组均加重，但镁干预组随着镁离子浓度的增加钙化结节逐渐变小，镁离子浓度为2 mmol/L开始出现钙化结节缩小，3 mmol/L钙化结节达最小。钙含量检测结果与钙化染色结果基本一致，二者均提示镁离子可以抑制高磷诱导的钙化，并呈现一定的浓度依赖性，这与Figueiredo等[11]的研究结果相似。ALP是成骨细胞形成的早期标志物，在正常VSMCs中的表达水平较低，在钙化的血管和心脏瓣膜组织中的表达水平明显增高[12]。本研究发现，与高磷组比较，镁干预组随着镁离子浓度的增大ALP活性逐渐降低，且呈一定的浓度依赖性，进一步验证了镁离子具有抑制VSMCs转分化和钙化的作用。

Cbfα1是成骨样细胞表型转化的的特异性因子，是骨形成过程中的主要调节因子，其也可在发生钙化的VSMCs中表达[12]。Cbfα1在ALP的表达调节中起着重要作用，同时也是成骨样转分化的分子标志物[13]。Byon等[14]研究发现VSMCs在双氧水刺激下，其Cbfα1的表达与ALP活性的变化有紧密关系。本研究结果显示，镁离子可抑制VSMCs中Cbfα 1 mRNA的表达，且随着镁离子浓度增大，Cbfα1 mRNA的表达水平逐渐降低。综合本研究结果，并结合相关文献，笔者推测镁离子对VSMCs的钙化抑制作用可能是通过降低VSMCs中Cbfα1的表达来实现的。VSMCs中Cbfα1表达降低后，又通过其下游某一信号通路而致使ALP活性下降，进一步抑制血管钙化的发生，但二者之间的具体作用机制尚待进一步研究。

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