1,25(OH)2D3在牙乳头干细胞成骨分化中的作用*

李长春 孙莲莲 姜忠敏 李艳霞 盛 凤 刘晓智△

1,25(OH)2D3在牙乳头干细胞成骨分化中的作用*

李长春1孙莲莲1姜忠敏2李艳霞3盛 凤3刘晓智3△

目的 研究1,25-二羟基维生素D3[1,25(OH)2D3]在牙乳头干细胞向成骨细胞分化过程中的作用。方法分离培养儿童牙乳头干细胞，培养基中添加1,25(OH)2D3，使其终浓度分别为1、10和100 nmol/L，另设对照组加入等体积生理盐水。采用噻唑蓝（MTT）法绘制细胞生长曲线，流式细胞术检测细胞增殖周期变化，Western blot法检测维生素D受体（VDR）、核因子-κB受体活化剂配体（RANKL）及骨保护素（OPG）蛋白表达水平。采用siRNA技术沉默VDR表达后（siR-VDR组），检测其对RANKL和OPG蛋白表达的影响。结果对照组及1、10、100 nmol/L 1,25(OH)2D3组增殖指数（PIx）分别为49.78±2.03、50.14±1.55、48.81±1.91和48.56±2.15，不同浓度1,25(OH)2D3对牙乳头干细胞的增殖无明显作用（F=3.174，P＞0.05）。对照组牙乳头干细胞中可见一定水平VDR、RANKL和OPG的蛋白质表达；加入1,25(OH)2D3后，VDR、RANKL和OPG蛋白表达水平均有不同程度升高，其中以VDR上升趋势最为显著；转染siRVDR后，VDR、RANKL和OPG的蛋白质表达水平下降。结论1,25(OH)2D3通过调节VDR水平影响牙乳头干细胞向成骨细胞方向的分化过程。

RANK配体；骨保护素；受体,骨化三醇；牙乳头干细胞；维生素D受体；1,25(OH)2D3

牙乳头干细胞是儿童乳恒牙更替期的细胞结构基础，儿童在此时期内的营养摄入不足将对其产生重要影响[1]。维生素D3是维生素D中生物代谢率最高的一种活性形式，其主要生理功能是促进肠道钙吸收，诱导骨质钙磷沉着，儿童期缺乏维生素D3将可能导致佝偻病等严重后果[2]。本课题组在近期研究中发现维生素D受体（vitamin D receptor，VDR）、核因子-κB受体活化剂配体（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）及骨保护素（osteoprotegerin，OPG）均可能参与儿童乳恒牙更替期牙乳头干细胞的增殖和发育[3]，但具体机制不明。本研究在此基础上，探讨三者之间的相互作用关系，以明确三者对牙乳头干细胞的生长调控机制，指导儿童对维生素D3的营养摄入。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料 胎牛血清（杭州四季青），DMEM/F12培养基、胰蛋白酶，LipoVecTM（Invitrogene公司），靶向VDR的siRNA由武汉晶赛生物技术有限公司合成；RANKL多克隆抗体（美国Chemicon公司），OPG多克隆抗体及VDR多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）。实验牙齿来自接受正畸治疗儿童患者拔除的前磨牙。

1.2 牙乳头干细胞的分离与培养 将接受正畸治疗患儿拔除的前磨牙牙胚置于培养液中，用含有抗生素的PBS进行反复冲洗后，在尚未形成根尖的牙根部分分离牙乳头，PBS冲洗3次，锐器剪碎后用25 g/L的胶原酶混悬，37℃孵育箱内消化1 h。用含胎牛血清的培养液反复轻柔吹打至细胞团离散，500 r/min离心10 min，弃上清后DMEM重悬，接种至T25培养瓶内，于5%CO2、37℃条件下进行原代培养，24 h后半量换液，待细胞长满瓶底80%，0.25%胰蛋白酶消化。

1.3 绘制细胞生长曲线 设1 nmol/L浓度组、10 nmol/L浓度组、100 nmol/L浓度组和对照组。将牙乳头干细胞按1×104个细胞/孔接种于24孔板，24 h后更换新鲜的培养液，前3组加入1,25-二羟基维生素D3[1,25(OH)2D3]，使其终浓度分别为1、10和100 nmol/L，对照组加入等体积生理盐水。采用噻唑蓝（MTT）法绘制细胞生长曲线，按试剂盒说明进行操作。

1.4 流式细胞术检测细胞增殖周期 设1 nmol/L浓度组、10 nmol/L浓度组、100 nmol/L浓度组和对照组。作用48 h后胰酶消化获得单细胞悬液，PBS漂洗3次，无水乙醇固定，RNaseA消化，PI染色30 min后行流式细胞仪检测，CELLQuest软件采样分析结果，计算增殖指数[PIx=(S+G2M)/(G0G1+ S+G2M)]。

1.5 Western blot实验 提取细胞总蛋白，采用Bradford法进行蛋白定量。电泳后考马斯亮蓝染色，蛋白分离满意后转膜，Western封闭液37℃封闭2 h，PBS充分漂洗后滴加相应一抗，抗体稀释度分别为VDR（1∶1 000）、RANKL（1∶1 000）和OPG（1∶2 000），4℃水平摇床过夜，次日使用辣根酶标记的1∶500稀释二抗37℃1 h。化学发光试剂盒显影，Bio-Rad凝胶成像系统扫描光密度值，Quantity One软件分析。

1.6 siR-VDR质粒构建与细胞转染 设对照组、1 nmol/L浓度组、10 nmol/L浓度组、100 nmol/L浓度组和siR-VDR组5组。根据NCBI基因数据库检索出VDR的mRNA基因全长，将其编码区用基因沉默设计软件设计siRNA，寡核苷酸序列为5′-UUGGUCACGUCACUGACGC-3′。取生长状态良好，细胞融合度接近70%的牙乳头干细胞进行质粒瞬时转染。将1 μg的质粒与100 μL的LipoVecTM混合20 min后加入培养基中，12 h后换成常规培养基继续培养，加入终浓度为100 nmol/L的1,25(OH)2D3。48 h后采用Western blot检测VDR、RANKL和OPG的蛋白表达水平，操作方法同1.5。

1.7 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行统计处理，计量资料数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 牙乳头干细胞的培养在培养24 h后可见少量细胞贴壁生长，此后逐渐形成大的集落，集落进一步融合，细胞形态呈长梭形，铺路石样分布。生长至第6天时，行第1次传代，以后每3～4天传代1次，见图1。

Figure 1 The morphology of early-stage dental papilla stem cells图1 牙乳头干细胞早期形态（×100）

2.2 细胞生长曲线实验结果 各相同时点各组细胞数差异均无统计学意义（均P＞0.05），见图2。

Figure 2 The cell growth curves in different concentrations of 1,25(OH)2D3图2 不同浓度1,25(OH)2D3作用下的细胞生长曲线

2.3 细胞周期检测结果 各组牙乳头干细胞周期分布差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

Table 1 Comparison of cell cycles between different concentrations of 1,25(OH)2D3表1 不同浓度的1,25(OH)2D3作用下细胞周期比较

2.4 Western blot检测结果 3个不同浓度1,25(OH)2D3组VDR蛋白表达水平均明显高于对照组，且100 nmol/L浓度组高于1 nmol/L浓度组和10 nmol/L浓度组；siR-VDR组VDR蛋白表达水平均低于对照组和3个不同浓度1,25(OH)2D3组（均P＜0.05）。RANKL和OPG蛋白质表达水平随1,25(OH)2D3的浓度增加而升高，且均高于对照组；siR-VDR组RANKL和OPG蛋白表达水平均高于对照组，低于100 nmol/L浓度组（均P＜0.05），见图3。

Figure 3 The effect of 1,25(OH)2D3on expression levels of related genes detected by Western blot assay图3 不同浓度1,25(OH)2D3对VDR、RANKL和OPG蛋白质表达的影响

3 讨论

乳恒牙更替期是儿童颌面部和牙齿生长发育中的一个重要阶段，儿童在该时期内的营养均衡将对于乳牙脱落及恒牙健康萌生产生重要影响[4]。牙齿与骨均为矿化组织，其形成和改建过程有相似之处。但对于RANKL和OPG的研究目前多集中于成骨和破骨作用等骨的发育和改建方面，在牙齿替换方面的研究较少。

破骨细胞的分化与成熟离不开成骨细胞，并需要两者间细胞与细胞的接触作用。近年来RANKL/ OPG系统作为破骨细胞发生的最终的调节因子的学说成为骨科生物学研究领域的重要进展。该系统几乎能够调控破骨细胞所有方面的功能，包括增殖、分化、融合、活化和凋亡[5]。牙齿发育过程中，牙乳头干细胞和牙囊细胞是颅神经嵴细胞发生广泛的迁移、分化、增殖而形成的来源于外胚层的牙源性间充质细胞。牙乳头干细胞中含有牙髓细胞、成牙本质细胞等细胞的祖细胞成分，在牙齿发育过程中逐渐形成牙髓、牙本质。生长因子、发育调控基因等因素可以影响体外培养的牙乳头的增殖、分化和矿化，进而影响牙胚的发育进程。研究表明牙乳头干细胞在儿童乳恒牙更替期发挥核心作用，任何影响该类细胞生长、分化的条件改变，均将影响儿童恒牙的萌发与生长[6]。

本研究显示，不同浓度1,25(OH)2D3对牙乳头干细胞的增殖无明显作用。Western blot结果显示，在加入不同浓度1,25(OH)2D3后，VDR、RANKL和OPG的蛋白表达水平均有明显升高，其中以VDR上升趋势最为显著，且3个基因的蛋白表达水平与1,25(OH)2D3浓度呈剂量相关性。VDR是1,25(OH)2D3的直接作用靶点，当外界环境中1,25(OH)2D3的浓度增高时，常会诱导VDR的高表达，本研究也验证了这一点。为进一步了解三者对乳恒牙更替期的生长调控机制，本研究利用RNA干扰技术特异性沉默VDR在牙乳头干细胞中的表达，结果显示，当转染siR-VDR后，VDR的蛋白质表达被有效沉默，RANKL和OPG的蛋白质水平均有所下降，提示1,25(OH)2D3可能通过调节VDR水平间接调控RANKL和OPG的表达，进而影响牙乳头干细胞向成骨细胞方向的分化过程。由此推测儿童乳恒牙更替期适量摄入1,25(OH)2D3对于乳恒牙健康生长发育是必要的。但因机体中存在复杂的调控网络，摄入1,25(OH)2D3的确切剂量仍有待于进一步研究。

[1]王晓春,于海燕,毕佳锐,等.基质金属蛋白酶在健康牙齿和龋齿成牙本质细胞中的表达[J].天津医药,2013,41(1):12-14.

[2]穆玉,陈乃玲,彭伟,等.羧甲基壳聚糖温敏凝胶对小鼠L929细胞增殖的影响[J].天津医药,2012,40(4):363-365,421.

[3]Liu H,Cao T.Dental application potential of mesenchymal stromal cells and embryonic stem cells[J].Chin J Dent Res，2010,13(2):95-103.

[4]Saber SE.Tissue engineering in endodontics[J].J Oral Sci,2009,51 (4):495-507.

[5]Cao Y,Xia DS,Qi SR,et al.Epiregulin can promote proliferation of stem cells from the dental apical papilla via MEK/Erk and JNK signalling pathways[J].Cell Prolif,2013,46(4):447-456

[6]Kawashima N.Characterisation of dental pulp stem cells:a new horizon for tissue regeneration[J]?Arch Oral Biol,2012,57(11):1439-1458.

（2013-09-01收稿 2013-12-31修回）

（本文编辑 陈丽洁）

Functional Roles of 1,25(OH)2D3in Osteogenic Differentiation of the Dental Papilla Stem Cells

LI Changchun1,SUN Lianlian1,JIANG Zhongmin2,LI Yanxia3,SHENG Feng3，LIU Xiaozhi3
1 Department of Stomatology,2 Department of Pathology,3 The Central Laboratory，The Fifth Central Hospital of Tianjin, Tianjin 300450,China

Objective To study the functional roles of 1,25(OH)2D3in osteogenic differentiation of the dental papilla stem cells.MethodsThe dental papilla stem cells were isolated and cultured in medium supplemented with different concentrations of 1,25(OH)2D3(1,10 and 100 nmol/L).MTT assay was used to detect the cell growth,and flow cytometry was used to detect the cell cycle.Western blot assay was used to detect protein expression levels of receptor activator of nuclear factor-κB ligand(RANKL),osteoprotegerin(OPG)and vitamin D receptor(VDR).After siRNA silencing VDR expression, protein levels of RANKL and OPG were detected.ResultsMTT and flow cytometry results showed that there were no significant differences in the cell proliferation between different concentrations of 1,25(OH)2D3(1,10 and 100 nmol/L)and control groups(P＞0.05).Western blot results showed that there were protein expressions of VDR,RANKL and OPG in control group.The protein expressions of VDR,RANKL and OPG were increased after adding 1,25(OH)2D3,in which the upward trend was the most significant in VDR.After VDR expression was silenced by siRNA,the protein expression levels of VDR, RANKL and OPG were decreased.Conclusion1,25(OH)2D3affects the osteoblast differentiation process of the dental papilla stem cells by adjusting the VDR expression.

RANK ligand;osteoprotegerin;receptors,calcitriol;dental papilla stem cells;vitamin D receptor; 1,25(OH)2D3

R788

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.05.006

*天津市卫生局科技基金项目（项目编号：2011KZ25）

1天津市第五中心医院口腔科（邮编300450），2病理科，3中心实验室

△通讯作者 E-mail：lxz7997@126.com