癌相关成纤维细胞通过Gro-α激活NF-кB核转位和VEGF表达促进卵巢癌的生长

任春霞 徐娜 宋亚琴 赵敏 陈亚萍 吕蓓 杨恭

1.江苏省无锡市人民医院妇产科，江苏 无锡 214023；2.山东省交通医院妇产科，山东 济南 250031；3.复旦大学附属上海市第五人民医院妇产科，复旦大学上海医学院妇产科学系，上海 200240；4.复旦大学附属上海市第五人民医院中心实验室，复旦大学上海医学院妇产科学系，上海 200240；5.复旦大学附属肿瘤医院肿瘤研究所，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032

癌相关成纤维细胞通过Gro-α激活NF-кB核转位和VEGF表达促进卵巢癌的生长

任春霞1 徐娜1 宋亚琴1 赵敏2 陈亚萍3 吕蓓1 杨恭4,5

1.江苏省无锡市人民医院妇产科，江苏 无锡 214023；2.山东省交通医院妇产科，山东 济南 250031；3.复旦大学附属上海市第五人民医院妇产科，复旦大学上海医学院妇产科学系，上海 200240；4.复旦大学附属上海市第五人民医院中心实验室，复旦大学上海医学院妇产科学系，上海 200240；5.复旦大学附属肿瘤医院肿瘤研究所，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032

背景与目的：卵巢癌相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts，CAF)促进上皮肿瘤的发生，其分泌的趋化因子即生长调节致癌基因α(growth-regulated oncogene alpha，Gro-α)蛋白在肿瘤间质微环境中促进上皮卵巢癌的发生，但其作用机制并不清楚。本研究拟测定Gro-α蛋白是否通过激活间质成纤维细胞中NF-кB核转位和VEGF表达，促进卵巢癌的生长。方法：本研究采用ELISA法测定了两株卵巢癌CAF和两株正常卵巢组织成纤维细胞(normal fibroblasts，NF)条件培养基(conditioned medium，CM)中Gro-α的表达；用CAF-CM或Gro-α分别处理NF，并以NF-кB抑制剂处理作为对照；用蛋白质印迹法(Western blot)测定样品处理前后NF-кB和血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等分子的变化；然后用CAF或NF分别与卵巢癌细胞系OVCA429混合接种BALB/c裸小鼠，或在有、无NF-кB抑制剂PS1145处理的NF中，用CAFCM或Gro-α处理后，分别与OVCA429混合接种动物，观察和比较动物移植瘤生长及移植瘤组织中微血管形成情况。结果：Gro-α在CAF中比在NF中高5～6倍；与对照组相比，用CAF条件培养基或Gro-α处理的NF中NF-кB p65的核转位升高，且VEGF上升，但血管生成抑制因子-血小板反应蛋白1下降；用NF-кB抑制剂同时处理NF，可以逆转其VEGF和TSP-1的表达水平；动物试验结果发现CAF要比NF更易促进肿瘤生长，而CAF-CM或Gro-α处理的NF细胞可以促进动物移植瘤的快速增长和移植瘤组织中微血管的生成，但用NF-кB抑制剂处理的NF则抑制肿瘤生长和血管形成能力。结论：卵巢癌CAF在肿瘤微环境中通过自分泌Gro-α，激活NF-кB核转位和VEGF表达，促进卵巢癌组织血管增生和肿瘤的生长。

癌相关成纤维细胞；生长调节致癌基因α；NF-кB核转位；血管内皮细胞生长因子；卵巢癌

肿瘤间质微环境对肿瘤的发生、发展具有重要的作用，其中癌相关成纤维细胞(cancerassociated fibroblasts，CAF)对上皮类肿瘤的发生影响尤为显著［1］。因此，近年来CAF调节肿瘤发生、发展的机制越来越受到关注和深入的研究。例如CAF作为肿瘤微环境中的主要间质细胞，其通过Hedghog信号对前列腺癌具有重要的促进作用［2］。另有报道发现，CAF通过HOXA9调节卵巢癌的生长［3］。此外，CAF可能通过AKT1介导的对乳腺上皮细胞中半胱氨酸蛋白酶抑制剂的表观遗传学沉默来促进乳腺癌的发生［4］。

血管生成对肿瘤的形成异常重要，是肿瘤细胞获得营养和进行细胞生长、分裂、侵袭和转移的主要动力［5］。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是调节肿瘤血管形成的主要因子之一，VEGF与上皮膜蛋白2一起促进子宫内膜癌的血管生成和肿瘤生长［6］；此外，VEGF与内皮细胞特异性分子Endocan相互作用，促进膀胱癌的发生［7］。因此，靶向VEGF及其受体的药物开发早已是肿瘤治疗的首选策略之一［8］。

除了内服“宣肺通窍汤”外，我们应用传统的熏鼻外治法，正是祖国医学独有的芳香治疗法。我们总结了熏鼻外治法的优势有：①改善嗅觉的传导性通路：促进鼻腔血液循环，有利炎症和水肿的吸收，缓解鼻塞且症状改善持久，其作用优于减充血剂和鼻用激素。②改善嗅觉的化学性通路：辛夷、藿香、白芷、公丁香、石菖蒲、川芎等药物都含有植物挥发油，加热后具有不同的芳香气味，可以起到芳香开窍的作用。

生长调节致癌基因α(growth-regulated oncogene alpha，Gro-α)蛋白，是由107个氨基酸组成的相对分子质量约为11.3×103的细胞因子，其受体主要是与IL-8共用的CXCR2［9］。我们早期的研究发现，趋化因子Gro-α蛋白可以使永生化的卵巢上皮细胞转化为癌细胞，而且Gro-α可以诱导卵巢间质成纤维细胞的衰老，进而促进卵巢上皮细胞的恶性转化，在卵巢癌患者的血液和临床标本中均可检测到上升的Gro-α［10］。有其他研究表明，凝血酶可以通过上调Gro-α促进血管生成［11］。在多发性骨髓瘤中，Gro-α等分子与肿瘤血管形成和疾病的预后密切相关［12］。此外，有报道发现Gro-α在结肠癌肝转移的细胞中诱导的信号转导通路主要与NF-кB及AKT相关［13］。然而，Gro-α是否通过激活NF-кB诱导成纤维细胞衰老和促进血管形成，目前鲜见报道。本研究利用体外细胞学实验和体内动物实验发现Gro-α可能是

通过激活NF-кB和肿瘤血管形成促进卵巢癌发生的。

1 材料和方法

1.1 细胞系和培养基

卵巢癌细胞系OVCA429由美国M.D. Anderson癌症中心赠与，具有体外软琼脂单独生长形成克隆特性和裸鼠体内致瘤活性。培养基为含10%胎牛血清、1 mmol/L非必需氨基酸、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素及100 μg/mL链霉素的RPMI-1640(购自Gibco公司)，培养环境为37 ℃、CO2体积分数为5%的恒温培养箱。

CAF和正常卵巢组织成纤维细胞(normal fibroblasts，NF)来源于无锡市人民医院妇产科2012年9月—2013年6月收治的5例卵巢癌患者。所有患者均为初治患者，术前均未接受任何治疗。CAF取自高级别浆液性卵巢癌组织5例；NF取自乳腺癌患者行去势的正常卵巢组织3例。标本获取前均与患者签署知情同意书，获得患者许可。成纤维细胞分离的方法详见文献［10，14］，基本过程如下：将组织块用含10%双抗的PBS温和的清洗3次，每次5 min，然后用培养基清洗1次，最后把组织置于新的含有15%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺和10%双抗的细胞培养基中，用无菌手术刀片切开组织，温和地刮取切面细胞，也可用刀背钝性刮取，之后将细胞在37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养3～5 d之后更换1次培养基，以后每隔3 d更换1次培养基。14 d后，细胞长满培养皿。当细胞密度长到80%～90%时，用胰酶消化并以1∶3进行细胞传代。如果成纤维细胞中掺杂有上皮细胞，可以采用以下方法移除：将培养基吸弃，加入PBS温和洗涤细胞2次，加入0.5 mL 0.05%的胰酶(含EDTA)，在室温下处理并用显微镜持续观察，大约60 s后，成纤维细胞脱壁而上皮细胞仍然贴壁，此时立即用培养基中和，把培养基中成纤维细胞移至另外一个新的培养皿中，从而将成纤维细胞和上皮细胞分开，成纤维细胞传代2～3次就可以得到纯化的成纤维细胞。如果不纯，可以用胰酶反复消化处理。目前已经成功分离和构建到生长良好的5株CAF和3株NF，实验中使用CAF和NF分别为体外第3次和第5次传代细胞群，无明显衰老表型，在软琼脂中不能独立生长形成克隆，而卵巢癌细胞系OVCA429可以在软琼脂中形成克隆。

他跳上望天归，站在悬崖的边缘，仰天望，头顶繁星漫天，低头看，脚下深渊无底。他心里乱作一团，女孩的倩影和微笑，黑袍人诱惑的言语，天葬刀邪笑着的双瞳，族人们虔诚的跪拜，族长严厉的指责，师父不安甚至绝望的表情……种种景象在他的眼前浮现，一层层重叠，交叉，粉碎，令他头痛欲裂。

在国际上，因免费开放的、前沿性的课程使网络课程引来了广泛的关注。如美国之音“教育报道”栏目曾报道过许多关于网络课程的新闻；英国还发布的《MOOCs和开放教育对高等教育的影响》白皮书；一些顶尖大学开始建立开放学习平台并将其课程放在网上[4]。美国麻省理工学院提出了“开放式课程网页”的概念，并向全世界的学习者无偿提供世界级的优秀课程资源。

1.3 条件培养基或Gro-α处理NF

本研究检测了CAF19和NF23细胞核与细胞质中NF-кB p65亚基的表达，发现CAF细胞核中p65表达比其细胞质中的表达高5倍以上(图2A)。随后本研究采用含CAF19的CM处理了NF23，分别收集0、12和24 h处理的细胞，采用Western blot测定了细胞核和细胞质蛋白组分的p65水平。结果发现，与无血清培养基处理的细胞相比，p65核转位随处理时间延长而增高(图2B)。但用Gro-α中和抗体(购自美国R&D System公司)处理的细胞中，NF-кB的核转位降低(图2B)。之后，本研究发现用Gro-α处理的细胞也有NF-кB p65亚基的核转位，而加入Gro-α中和抗体则抑制NF-кB的核转位(图2C)。说明卵巢癌间质成纤维细胞因其自分泌的Gro-α进行信号转导，激活了NF-кB的核转位；而Gro-α处理的正常间质细胞中，也可以激活NF-кB核转位，进而启动下游相关基因的表达。

1.3.1 CM的收集

将CAF(第3代)在100 mm培养皿中进行正常单层培养至75%的密度，然后更换无血清培养基继续培养48 h后收集的培养基即为CAF-CM。

1.2 酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)

1.3.2 细胞处理

2011年，中共中央1号文件《中共中央国务院关于加快水利改革发展的决定》明确提出要确立水功能区限制纳污红线，从严核定水域纳污能力，严格控制入河湖排污总量。为推进实行最严格水资源管理制度，确保实现水资源开发利用和节约保护的主要目标，国务院办公厅印发了《实行最严格水资源管理制度考核办法》，对各省（自治区、直辖市）重要江河湖泊水功能区2015、2020、2030年水质达标率控制目标均提出了要求。

将NF(第5代)在35 mm培养皿中正常培养至

习近平总书记这样寄语当代青年大学生:“现在在高校学习的大学生都是20岁左右,到2020年全面建成小康社会时,很多人还不到30岁;到本世纪中叶基本实现现代化时,很多人还不到60岁。也就是说,实现‘两个一百年’奋斗目标,你们和千千万万青年将全过程参与。”[13]可见,当今青年一代学生,是同新时代共同前进的一代人,在离开学校,走上社会之后,将会成为国家改革发展的生力军,担负起民族复兴的重要责任,青年的素质能力和精神面貌,将对我国宏伟蓝图的实现产生巨大而深远的影响。当代中国青年“生逢其时,责任重大”[14]。青年发展观,正是习近平青年观的理论核心。

1.4 Western blot法检测蛋白表达

用细胞核与细胞质蛋白抽提试剂盒(购自上海碧云天生物科技有限公司，货号P0027)对上述处理的细胞进行细胞核与细胞质蛋白的分离和提取，最后用BCA法分别测定蛋白浓度。用蛋白质印迹法(Western blot)进行NF-кB和VEGF、血小板反应蛋白1的检测。细胞核蛋白以TFⅡB作为加样对照，细胞质蛋白用β-actin作为对照。

1.3.3 细胞核与细胞质蛋白的分离

75%的密度，然后用CAF-CM或300 ng/mL的人重组Gro-α(购自美国R&D System公司)、Groα+Gro-α中和抗体(购自美国R&D System公司)或Gro-α+PS1145(NF-кB抑制剂，购自美国Sigma公司，20 μmol/L)处理NF 48 h，收集0、24和48 h处理的细胞样品，用PBS或无血清培养基处理48 h的细胞作为对照。细胞的蛋白组分用下述方法进行提取。

检测用抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。裂解蛋白用6×的SDS加样缓冲液(125 mmol/L Tris-HCl pH为6.8、2%SDS、20%甘油、0.2%的溴酚蓝)制备成统一适当浓度的样品。样品分离前，用100 ℃的水浴处理样品3～5 min。每种样品取25 µg，用10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样品。之后将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF membrane)上，并用10%的脱脂奶粉(Bio-Rad)封闭2 h(室温或4 ℃)。此后依次加入一抗和HRP(辣根氧化物酶)-偶联的二抗(依一抗而定)。期间用含1%吐温-20的TBS(Tris-HCl，pH为7.5)洗涤3次。蛋白-抗体复合物用化学发光底物(ECL购自Millipore公司)进行显色后，用LAS4000化学发光成像分析仪曝光显色。

生态环境是经济、社会、文化发展的基础，是村民安居乐业的前提条件。为了实现生态可持续发展，乡村应积极推广环保教育、加强环境整治、修复生态景观、倡导生态建造。

1.5 动物试验

动物试验分为2组，第1组分别将CAF19 (第3代)、NF23(第5代)、OVCA429单独接种，或将CAF19和NF23分别与OVCA429混合接种(1∶50)，观察动物成瘤率和瘤体增长体积；第2组以NF23与OVCA429细胞混合接种为基础，同时设用CAF-CM或Gro-α处理的NF23细胞组，以及用CAF-CM或Gro-α处理NF23时加入PS1145以抑制NF23中NF-кB的活性，接种时NF23与卵巢癌细胞系OVCA429也按1∶50的比例混合。所有动物为6～8周龄BALB/c裸小鼠(购自上海斯莱克公司)。每个细胞系接种5只裸鼠，接种方法为每只动物皮下两侧各接种1个点，共10个点；每个点接种的细胞总数为500万。移植瘤体积(V)用ab2×0.52公式计算，其中a为肿瘤长径，b为短径，0.52是一个经验常数［15］。动物实验在复旦大学实验动物科学部进行，通过了相关伦理委员会的审查。动物移植瘤组织的病理学染色和检测见文献。

考虑风电不确定性的电气能源系统两阶段分布鲁棒协同调度//税月,刘俊勇,高红均,邱高,胥威汀,苟竞//(13):43

试验对生长传代较好的2株CAF(第3代)和2株NF(第5代)培养基中的Gro-α进行了测定。细胞培养基的收集见2.3，培养基中Gro-α的测定按试剂盒(购自美国R&D System公司)操作说明。检测步骤如下：①用PBS稀释一抗(Gro-α Ab)到0.25 µg/mL，迅速加入100 µL到每个孔中，室温温育过夜。②吸出液体，每孔用300 µL缓冲液洗板4次。最后1次洗完后在纸上翻转板，除去残余的缓冲液。③每孔中加300 µL的封闭液，在室温下至少温育1 h。洗板4次，方法同上。④然后将Gro-α标准品(1、0.75、0.5、0.25、0.125及0 ng/mL)进行稀释，加100 µL的标准品或者条件培养基(conditioned medium，CM)到每个孔中，设3个复孔，在室温中至少温育2 h。⑤洗板4次，稀释检测抗体到1.0 µg/mL，每孔加100 µL。在室温温育30 min。⑥洗板4次，以1∶2 000稀释Avidin-HRP第二抗体，每孔加100 µL，室温温育30 min。之后洗板4次，每孔加100 µL显色剂，室温下温育，观察颜色变化。⑦最后每孔加入终止液50 µL，用(650 nm波长)酶标仪读取A值，按标准曲线计算出Gro-α相对浓度。

2 结 果

2.1 Gro-α分泌水平

本试验测定了两株卵巢癌CAF(CAF19和CAF46)和两株正常卵巢NF(NF23和NF65) CM中Gro-α的水平，发现CAF条件培养基中Gro-α＞820 pg/mL，而NF条件培养基中Gro-α浓度＜210 pg/mL；卵巢癌细胞OVCA429条件培养基中Gro-α的浓度为298±43 pg/mL(图1)。在后续的实验中我们主要使用CAF19的CM或人重组Gro-α(浓度为300 ng/mL)处理NF23，同时以无血清培养基等作为对照处理细胞。

2.2 Gro-α激活NF-кB核转位

政府工作报告中指出，在多领域推进“互联网+”，为数字中国建设加油助力。大港油田结合油气开发实际，提出了在油藏和地面管道场站建设中应用物联网、大数据、云计算、移动应用技术，大力开展“数字场”建设。通过平台化、共享化、集成化，实现开发数据的自动实时采集，地质模型的自我更新，开发趋势的自我判断和预警，开发方案自动比选和智能决策，进而实现油藏全生命周期的智能化研究与管理，以此提高劳动效率和开发效益。

2.3 Gro-α通过NF-кB促进VEGF表达，但抑制TSP-1表达

Gro-α介导的细胞信号可能主要通过其与受体CXCR2结合激活NF-кB通路，启动下游分子的转录。VEGF是肿瘤血管生成的主要刺激因子，因此我们测定了Gro-α是否通过激活NF-кB促进VEGF表达。结果发现，用Gro-α处理的NF23细胞质中VEGF升高，而血管生成抑制因子TSP-1(血小板反应蛋白1)的表达降低，但是用PS1145处理细胞可见NF-кB核转位下降，细胞质中VEGF下降，而TSP-1升高(图3)。由此可见，Gro-α诱导的间质成纤维细胞，可能通过激活NF-кB促使VEGF升高，而抑制TSP-1降低，进而调节肿瘤组织的血管形成和肿瘤生长能力。

图3 Gro-α通过激活NF-кB上调VEGF下调TSP-1Fig. 3 Up-regulation of VEGF and down-regulation of TSP-1 through the activation of NF-кB by Gro-α

2.4 Gro-α处理的NF通过促进血管生成，加速卵巢癌细胞的肿瘤生长能力

为了检测Gro-α诱导的NF-кB活化和VEGF的表达是否促进上皮卵巢癌细胞的肿瘤形成和生长能力，本研究单独接种CAF19、NF23或OVCA429，或将CAF19或NF23分别以1∶50的比例与卵巢癌细胞系OVCA429混合接种裸鼠(图4A)；或用不同组合处理的NF23与卵巢癌细胞系OVCA429混合接种裸鼠(图4B)。结果发现CAF19和NF23单独接种的动物不成瘤，而OVCA429作为卵巢癌细胞系可以单独成瘤；将CAF19或NF23与OVCA429混合后接种，发现CAF比NF能显著促进肿瘤的生长(图4A)；用CAF-CM或Gro-α处理的NF23比未处理或同时用NF-кB抑制剂PS1145处理的细胞更能增进肿瘤的生长(图4B)；试验代表性移植瘤的肿瘤组织及荷瘤动物图见图4C和4D。最后，我们对移植瘤组织分别进行组织学HE染色和血管内皮细胞特异抗原CD34的免疫组化分析，发现Gro-α水平的升高会促进肿瘤组织中微血管的增加(图4E、F)。

图4 动物移植瘤生长曲线以及移植瘤组织中微血管密度检测Fig.4 Growth curves of animal xenograft tumors and detection of micro-blood vessel density in xenograft tumor tissues

这些结果均表明，卵巢癌CAF中Gro-α可能以激活间质成纤维细胞NF-кB的核转位的方式，促进VEGF过量分泌，诱导肿瘤血管形成，加速肿瘤的生长。

3 讨 论

本试验利用人体卵巢癌和正常卵巢组织标本中分离的CAF和NF进行对比性研究，发现其自分泌的Gro-α主要通过激活NF-кB核转位，提高细胞分泌VEGF和降低TSP-1表达，促进卵巢癌血管生成和肿瘤的生长。

话刚落音，雨心不辞而别。茶馆顿时冷场了，蒋浩德悔不该打这个主意。年轻时，他就吃过雨心的闭门羹，老来还是这样。真想活个样子出来，找一个比她强百倍的人。紫云看在眼里，先稳住神，轻声说道：“伯伯也不必太悲伤，师母正在失夫之痛中，到时候……”

近年来研究发现，CAF可能在肿瘤微环境中对上皮肿瘤的发生、发展具有重要作用［16-17］。有研究发现，CAF中IL-8可能通过激活NF-кB，诱导结肠癌肝转移［18］。NF-кB作为炎性反应相关转录因子，在乳腺癌中对IL-8和VEGF表达具有重要的启动作用［19］。此外，在胰腺癌中，NF-кB的活化也与IL-8和VEGF的升高密切相关［20］。另外，以前也有研究发现，Gro-α可能通过激活NF-кB进行细胞内信号转导［21］。本研究结果表明，CAF通过自分泌Gro-α激活NF中NF-кB，使其分泌大量的VEGF，促进血管生成，对卵巢癌细胞的快速增生十分重要。

与NF相比，癌相关CAF具有体外传代次数少和快速衰老的特征，因此CAF衰老可能是组织微环境中细胞从炎性反应向恶性转化的特征。我们曾报道Gro-α可以促进NF衰老，衰老的NF产生更多细胞因子包括Gro-α，在动物体内可以诱导永生化上皮细胞形成肿瘤［10］。本研究揭示肿瘤血管生成的主要作用机制之一：即间质成纤维细胞由于NF-кB的激活而产生VEGF，其原动力之一可能是来自CAF分泌的Gro-α。本研究结果对于深入阐明肿瘤微环境中血管形成的机制和寻找以血管形成为靶点的药物或诊断分子可能具有一定的理论和临床意义。

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Promotion of ovarian tumorigenesis by cancer-associated fi broblasts through Gro-α activated NF-кB nuclear translocation and high expression of VEGF

REN Chun-xia1, XU Na1, SONG Ya-qin1, ZHAO Min2, CHEN Ya-ping3, LV Bei1, YANG Gong4,5(1.Department of Gynecology and Obstetrics, The People’s Hospital of Wuxi, Wuxi Jiangsu 214023, China; 2.Department of Gynecology and Obstetrics, Shandong Jiao Tong Hospital, Jinan Shandong 250031, China; 3.Department of Gynecology and Obstetrics, The Fifth People’s Hospital of Shanghai, Fudan University; Department of Gynecology and Obstetrics, Shanghai Medical College, Fudan University Shanghai 200240, China; 4.Central Laboratory, The Fifth People’s Hospital of Shanghai, Fudan University; Department of Gynecology and Obstetrics, Shanghai Medical College, Fudan University Shanghai 200240, China; 5.Cancer Institute, Fudan University Shanghai Cancer Center; Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

Correspondence to: LV Bei E-mail: lvbei@wuxiph.com

Background and purpose:Ovarian cancer-associated fi broblasts (CAF) are known to promote epithelial malignancy. The chemoattractant cytokine growth-regulated oncogene alpha (Gro-α) secreted from CAF has been reported to mediate the stroma-epithelia interaction in tumor microenvironment, leading to the development of epithelial ovarian cancer, however, the detailed mechanism is unknown.This study was to determine whether Gro-α could promote ovarian tumorigenesis through activating NF-кB nuclear translocation and VEGF expression in stromal fi broblasts.Methods:ELISA was used to measure the levels of Gro-α in two cancer-associated fi broblasts (CAF) and normal fi broblasts (NF) isolated from high-grade serous ovarian cancer or normal ovarian tissues. CAF conditioned medium (CM) or Gro-α was used to treat NF, while PS1145, the inhibitor of NF-кB, was used as control. NF-кB subunit p65 and vascular endothelial growth factor (VEGF) were detected by Western blot in cells after treatment. Xenograft tumors from nude mice were generated by injection of CAF, NF, or OVCA429 alone or OVCA429 mixed with CAF or NF, and by injection of OVCA429 mixed with NF cells that were treated with or without CAF-CM or Gro-α, or with NF cells that were treated with CAF-CM or Gro-α plus PS1145. The tumor growth curve was measured and the blood vessel density in xenograft tumor tissues was examined by histopathological analysis.Results:The levels of Gro-α were 5-6 folds higher in CAF than in NF. Treatment of NF with CAF-CM or Gro-α stimulated the nuclear translocation of NF-кB subunit p65, and the expression of VEGF, but suppressed the expression of thrombospondin 1, the antiangiogenesis factor, compared with control cells. However, treatment of NF with the NF-кB inhibitor PS1145 reversed these results. The animal assay revealed that CAF stimulated tumor growth stronger than NF, and NF treated with CAF-CM or Gro-α, but not along with PS1145, enhanced xenograft tumor growth through promoting angiogenesis.Conclusion:Ovarian CAF promotes the nuclear translocation of NF-кB and the expression of VEGF through Gro-α autocrine in tumor microenvironment to facilitate angiogenesis and ovarian cancer development.

Cancer-associated fi broblasts; Gro-α; NF-кB nuclear translocation; Vascular endothelial growth factor; Ovarian cancer

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.05.001

R737.31

A

1007-3639(2014)05-0321-08

2013-12-20

2014-04-11）

南京医科大学面上基金(No：2012NJMU179)；国家自然科学基金面上项目(No：NSFC91129721)。

吕蓓 E-mail:lvbei@wuxiph.com