不同作用时程高压氧治疗对神经病理性疼痛大鼠的影响

（中国医科大学附属盛京医院麻醉科，沈阳110004）

不同作用时程高压氧治疗对神经病理性疼痛大鼠的影响

韩光，李璐，李丹，赵平

（中国医科大学附属盛京医院麻醉科，沈阳110004）

目的探讨不同作用时程高压氧治疗对神经病理性疼痛大鼠的影响。方法成年雄性SD大鼠28只，采用随机数字表法，将其均分为4组：假手术组（S组）、坐骨神经慢性缩窄手术组（CCI组）、高压氧治疗5 d组（HBO 5 d组）、高压氧治疗10 d组（HBO 10 d组）。将HBO 5 d组和HBO 10 d组大鼠至于高压氧舱，以0.012 5 MPa/min的速率向舱内匀速加压直至目标压力并保持60 min。然后匀速减压至正常大气压。从术后第1天开始高压氧治疗，连续5 d或10 d，1次/d。S组和CCI组单纯放入氧舱100 min而不接受治疗。于术前1 d，术后1，2，3，7，14，21，28 d测定机械缩足反射阈值（MWT）和热缩足反射潜伏期（TWL）。术后28 d取材观察其脊髓的免疫组化指标，对一氧化氮合酶（NOS）表达进行比较。结果与S组比较，其他3组MWT降低，TWL缩短（P＜0.05）。与CCI组比较，HBO 5 d组和HBO 10 d组术后28 d MWT升高，TWL延长（P＜0.05），术后21 d 2组的MWT和TWL差异无统计学意义（P＞0.05）。术后21～28 d，HBO 5 d组和HBO 10 d组MWT和TWL差异有统计学意义（P＜0.05）。CCI后，NOS的表达明显增加，与CCI组比较，HBO5 d组与HBO 10 d组增加更显著（P＜0.05）。而HBO 5 d与HBO 10 d组差异无统计学意义（P＞0.05）。结论不同作用时程高压氧治疗均可减轻大鼠神经病理性疼痛，并且作用时间越长可能镇痛效果越持久。

高压氧；神经病理性疼痛；镇痛效果

高压氧具有增强抗氧化酶活性、加速清除自由基、提高血氧含量、改善微循环的作用，对损伤的神经组织有修复和保护作用，在临床上已广泛应用。本课题组前期研究表明，高压氧治疗可减轻大鼠神经病理性疼痛［1，2］，并且其镇痛效果与高压氧压力无关［3］，而与高压氧作用时间是否有关尚不清楚。本研究拟评价不同作用时间高压氧治疗对大鼠神经病理性疼痛的影响。

1 材料与方法

成年雄性SD大鼠28只，体质量350～400 g，由中国医科大学动物实验中心提供，采用随机数字表法，将其均分为4组：假手术组（S组）、坐骨神经慢性缩窄手术组（CCI组）、高压氧治疗5 d组（HBO 5 d组）、高压氧治疗10 d组（HBO10 d组）。

1.1 CCI模型的制备

大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉后，采用Bennett等［4］的模型行坐骨神经慢性缩窄术：取右后肢后外侧切口，在股骨后找到坐骨神经主干，分离右侧坐骨神经，用4-0丝线分别相距约1 mm的间距做松弛结扎，直到神经外膜稍稍受压为止。结扎标准为：使坐骨神经支配区域的肌肉出现暂短的收缩。然后分层缝合皮肤，待动物清醒后归笼饲养观察。假手术组大鼠则仅暴露坐骨神经而不结扎。

1.2 实验鼠的高压氧处理

HBO 5 d组从术后第1天开始连续5 d高压氧治疗，HBO 10 d组从术后第1天开始连续10 d高压氧治疗。预先将钠石灰置于高压氧舱底以减少水蒸气和CO2的蓄积，进舱后，先用纯氧洗舱10 min，使舱内O2浓度＞90%，加压速率为0.012 5 MPa/min，加压至0.25 MPa，在高压氧状态下停留60 min，其间用纯氧通气10 min。停留毕，以30 min匀速减至常压。S组和CCI组单纯放入氧舱100 min而不接受治疗，模拟除压力、氧浓度外的类同实验组的其他处理过程和环境条件。

1.3 取材

用1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，开胸经左心室插管至升主动脉，灌注0.9%的生理盐水至流出液不含红色，然后灌注含4%多聚甲醛的（0.1 mol/L）磷酸盐缓冲液（pH7.4）固定，取动物L4～L6腰段脊髓浸泡在4%多聚甲醛中待用。

1.4 观察指标

行为学检测于术前1 d（-1 d）及术后1，2，3，7，14，21，28 d上午9时～11时测定。除S组于手术当日行假手术外，其余3组均行坐骨神经结扎（CCI）。HBO 5 d组和HBO 10 d组在术后第1天开始分别连续高压氧治疗5 d和10 d。并在第28天处死留取标本。（1）自发性痛行为检测：观察鼠步态、右后肢体位、有无自噬行为及后肢持重等情况；（2）测定机械性缩足反射阈值（mechanical withdrawal threshold，MWT）：利用Von Frey纤维测量，参照Dixon［5］的方法。将大鼠置于升高的金属网上，盖以透明的有机玻璃罩。先让大鼠适应环境，用von Frey纤维垂直刺激大鼠后肢足底中部，使之稍成S形，持续6～8 s，观察是否出现缩足反应。纤维丝压力依次为0.4、0.6、0.8、1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0 g，每次间隔30 s；（3）热辐射法测定大鼠热刺激爪退缩阈值（thermal withdrawal latency，TWL）：采用光热测痛仪，利用聚光灯产生一定强度的光，通过产生热量致痛。将光辐射焦点对准大鼠足跖底中部，以大鼠抬腿或逃走的潜伏期作为热刺激爪退缩阈值。连续测3次，间隔5 min，取其平均值。为防止热辐射损伤，光照最长时限定为20 s。

新鲜标本用4%多聚甲醛固定4 h，常规脱水、浸蜡、包埋制作石蜡切片，厚度40 μm。切片经0.01 mol/L的PBS冲洗3次后，依次加入3%H2O2，30%封闭血清封闭10 min后加入抗一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）抗体（1∶200），4℃孵育48 h。PBS冲洗3次后，滴加生物素标记的第二抗体（羊抗兔IgG）。37℃孵育1.5 h后PBS冲洗，滴加辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育1.5 h后PBS冲洗，DAB显色，贴片，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜观察，棕色染色的为阳性细胞。阴性对照实验中，用PBS代替一抗或二抗，未见NOS样染色的神经元。每个脊髓切片时隔5张取1张，在Olympus光学显微镜下选取恒定位置脊髓背角Ⅰ～Ⅱ层计数NOS阳性神经元。

显微照相及图像分析应用U-MCB Olympus图像采集系统，METAMORPH/COOL SNAP+X/AX70显微（荧光）图像分析系统（VIC/ROPER OLYMPUS）US/JP，对切片进行分析处理，每只动物取4张切片，测定阳性细胞数值，放大400倍照相。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 一般行为学观察

各组大鼠试验期间未出现死亡，出现典型的触诱发痛阈值及热辐射阈值降低。HBO 5 d组有1只大鼠分离坐骨神经时机械损伤过重而被排除实验。CCI模型成功制备的标准：术后3 d即出现结扎侧患足足趾并拢背屈、外翻、成防御姿势，不负重，

患足行走无力，运动时明显跛行，膝关节着地，右足掌悬空或拖行；术后14 d左右患肢出现明显肌肉萎缩，患肢足底轻触刺激时，大鼠常将其迅速抬起并放入口中舔吮，在空中不停地甩动损伤侧后肢。假手术组未见上述现象。神经病理性疼痛大鼠出现足趾并拢、足外翻、舔足、甩足等行为学改变。

2.2 各组MWT及TWL比较

4组MWT和TWL基础值比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与S组比较，其余3组MWT降低，TWL缩短（P＜0.05）；HBO 5 d组和HBO 10 d组各时点MWT和TWL均较CCI组延长（P＜0.05）。术后21 d内HBO 5 d与HBO 10 d的MWT和TWL差异无统计学意义（P＞0.05）。术后28 d时，HBO 5 d组和HBO 10 d组MWT和TWL差异有统计学意义（P＜0.05），见表1，表2。

表1 各组大鼠机械性缩足反射阈值（MWT）的测量结果Tab.1 Mechanical withdraw threshold of rats in each group

表1 各组大鼠机械性缩足反射阈值（MWT）的测量结果Tab.1 Mechanical withdraw threshold of rats in each group

1）P＜0.05 vs group S；2）P＜0.05 vs group CCI.

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表2 各组大鼠热缩足反射潜伏期（TWL）的测量结果（Tab.2 Thermal withdrawal latency of rats in each group（

表2 各组大鼠热缩足反射潜伏期（TWL）的测量结果（Tab.2 Thermal withdrawal latency of rats in each group（

1）P＜0.05 vs group S；2）P＜0.05 vs group CCI.

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2.3 各组免疫组化结果比较

大体标本各组脑和脊髓标本未见异常。坐骨神经结扎后3 d即见结扎侧坐骨神经肿胀增粗。假手术侧坐骨神经干无肿胀、出血或粘连，容易暴露及游离。

S组、CCI组、HBO 5 d组、HBO 10 d组NOS阳性细胞数分别为（9.68±2.31）×10-4、（47.53±3.23）×10-4、（35.86±3.57）×10-4、（32.42±2.89）×10-4，与S组比较，CCI组、HBO 5 d组、HBO 10 d组NOS在脊髓胶质细胞数目显著增加（P＜0.05），与CCI组比较，HBO 5 d组和HBO 10 d组NOS细胞显著增加（P＜0.05），HBO 5 d组的NOS细胞较HBO 10 d组稍多，但2组无统计学差异（P＞0.05），见图1。

图1 各组脊髓胶质细胞NOS阳性细胞免疫组化×400Fig.1 Distribution of NOS positive cells in rats′spinal cord×400

3 讨论

近几年来高压氧治疗神经病理性疼痛已经在国内外期刊陆续被报道［1，2，6］。研究合适的压力、合适的作用时间等最佳治疗方案是这个问题的焦点之一。一些关于高压氧时机的研究侧重在高压氧

的作用时机，即早期或晚期。认为从HBO对NOS的作用看，不管是缺血早期还是晚期，应用HBO治疗都是有益的，但早期相对效果更好［7］。现在公认高压氧治疗的最佳时间窗是在组织损伤的6 h内［8］。但也有学者认为对于患者来说，在受伤后的6 h之内即可接受高压氧的治疗几乎是不可能完成的事情。他们认为高压氧可以改善血液循环，减轻局部水肿等，对受伤的神经元起到保护作用并防止进一步损伤［9，10］。因而损伤晚期应用高压氧亦有效。

本研究结果显示，不同高压氧作用时程大鼠MWT均升高，TWL均延长，但是，在术后21 d内，不同作用时程的高压氧治疗对痛阈等的影响无显著差异；28 d时表现为镇痛的效果延长，提示高压氧可以减轻大鼠神经病理性疼痛，且作用时程长可能延长其镇痛效果。其原因可能是HBO通过增强组织有氧氧化产生大量高能磷酸化合物ATP，使细胞膜上的Na+、K+-ATP酶及钙泵活性恢复，纠正了Ca2+超载，进而抑制了Ca2+依赖的NOS阳性细胞过分产生NO，达到镇痛目的的同时还保护了脊髓的结构［11，12］。作用时程长，Ca2+超载情况更容易受到抑制，镇痛效果就更长久。另外，高压氧可减轻或消退神经组织水肿、促进髓鞘再生、促进周围神经再生及激活的内源性阿片肽也可能是原因之一［13，14］。但不同作用时程对镇痛效果影响的原因尚不清楚，其具体机制有待本课题组进一步研究。

本实验不足之处在于时程设置的长短方面。更长的作用时程是否同样能有效提高效果，更长时间的高压氧是否会氧中毒［15］，时程的安全范围与镇痛效果的完美结合点在哪等等问题还有待于进一步探讨研究。虽然高压氧潜在的毒性机制不明确可能制约其应用，但高压氧在神经病理性疼痛的镇痛方面的发展前景还是相当广大的。

综上所述，高压氧治疗可减轻大鼠的神经病理性疼痛，并且更长的作用时程可以相对延长其镇痛效果。

［1］韩光，孟凌新，李璐，等.高压氧对神经病理性疼痛大鼠的疼痛行为学影响［J］.中国疼痛医学杂志，2011，17（6）：357-360.

［2］韩光，李璐，孟凌新，等.高压氧对神经病理痛大鼠NOS系统的影响［J］.中国疼痛医学杂志，2012，18（2）：104-107.

［3］赵柏松，丁远远，孟凌新，等.不同压力高压氧治疗对大鼠神经病理性痛的影响［J］.中华麻醉学杂志，2013，33（2）：159-162.

［4］Bennet GJ，Xie YK.A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man［J］.Pain，1988，33（1）：87-107.

［5］Dixon WJ.Efficient analysis of experimental observations［J］.Ann Rev Pharmacol Toxicol，1980，20（4）：441-462.

［6］Li F，Fang L，Huang S，et al.Hyperbaric oxygenation therapy alleviates chronic constrictive injury-induced neuropathic pain and reduces tumor necrosis factor-alpha production［J］.Anesth Analg，2011，113（3）：626-633.

［7］Thompson CD，Uhelski ML，Wilson JR，et al.Hyperbaric oxygen treatment decreases pain in two nerve injury models［J］.Neurosci Res，2010，66（3）：279-283.

［8］Michal M，Malgorzata D，Marcin Z，et al.Hyperbaric oxygen and hyperbaric air treatment result in comparable neuronal death reduction and improved behavioral outcome after transient forebrain ischemia in the gerbil［J］.Exp Brain Res，2013，224（1）：1-14.

［9］Garcia E，Silva-Garcia R，Mestre H，et al.Immunization with A91 peptide or copolymer-1 reduces the production of nitric oxide and inducible nitric oxide synthase gene expression after spinal cord injury［J］.J Neurosci Res，2012，90（3）：656-663.

［10］Gonzalez SL，Labombarda F，Deniselle MC，et al.Progesterone neuroprotection in spinal cord trauma involves up-regulation of brainderived neurotrophic factor in motoneurons［J］.J Steroid Biochem Mol Biol，2005，94（1-3）：143-149.

［11］Sumen G，Cimsit M，Eroglu L.Hyperbaric oxygen treatment reduces carrageenan induce acute inf l ammation in rats［J］.Eur J Pharmacol，2001，431（2）：265-268.

［12］Kahraman S，Du B，Kayali H，et al.Effects of methylprednisolone and hyperbaric oxygen on oxidative status after experimental spinal cord injury：a comparative study in rats［J］.Neurochem Res，2007，32（9）：1547-1551.

［13］Wilson HD，Wilson JR，Fuchs PN.Hyperbaric oxygen treatment decreases inflammation and mechanical hypersensitivity in an animal model of inflammatory pain［J］.Brain Res，2006，1098（1）：126-128.

［14］Zelinski LM，Ohgami Y，Chung E.A prolonged NO-dependent opioid-mediated antinociceptive effect of hyperbaric oxygen in mice［J］.J Pain，2009，10（2）：167-172.

［15］余平，牟燕华.高压氧治疗中的毒副作用及预防［J］.临床荟萃，2001，16（2）：71.

（编辑 武玉欣）

EffectofDifferent Hyperbaric Oxygen Exposure Time on Antinociceptive Response in Rat Neuropathic Pain Model

HAN Guang，LILu，LIDan，ZHAO Ping
（DepartmentofAnesthesiology，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate the effect of antinociceptive response induced by different hyperbaric oxygen（HBO）exposure in an animal model of neuropathic pain.MethodsA total of 28 healthy male SD rats were randomly divided into four groups（n=7）：Group S（sham group），Group CCI（chronic constrictive injury group），Group HBO 5 d（HBO duration for five days group）and Group HBO 10 d（HBO duration for ten days group）.Group CCI，group HBO 5 d and group HBO 10 d received the surgery of CCI，while group S only received sham operation.Rats of group HBO 5 d and group HBO 10 d received HBOone time perday for5 days or10 days since the 1stday aftersurgery.Afterputting rats inside the HBO chamber，the pressure was increased at a rate of 0.012 5 MPa/min to the desired pressure and maintained for 60 minutes.Rats of group S and group CCI were simply placed inside the chamber for approximately 100 min，but without HBO.The mechanical withdrawal threshold（MWT）and thermal withdrawal latency（TWL）of all animals were measured at 1 d before CCI，1 d，2 d，3 d，7 d，14 d，21 d and 28 d after CCI respectively.ResultsCompared with group S，MWT was significantly decreased and TWL was significantly shortened in other groups.Compared with group CCI，MWT was elevated and TWL was prolonged significantly in group HBO 5 d and HBO 10 d（P＜0.05）.Compared with group HBO 5 d，MWT was elevated and TWL was prolonged in group HBO 10 d（P＜0.05）after postoperative 21 days.There was no significant difference in alteration of the antinociceptive response effect between groups HBO 5 d and HBO 10 d within postoperative 21 days（P＞0.05）.After CCI treatment，the NOS expression was increased.NOS expression was significantly decreased in the HBO 5 d and HBO10 d groups.There was no significant difference between HBO 5 d and HBO 10 d.ConclusionDifferentHBOdurationsinfluenced antinociceptive effects on CCIrats with neuropathic pain.

hyperbaric oxygen；neuropathic pain；antinociception

R614

A

0258-4646（2014）02-0159-04

韩光（1978-），女，讲师，硕士.

赵平，E-mail：zhaop@sj-hospital.org

2013-10-20

网络出版时间：