免疫亲和柱-高效液相色谱法测定牛奶中氯霉素和玉米赤霉醇及其类似物

姚 佳，王 昕，张建新,*，李贤良，郗存显，王国民，王 雄，里 南，果 旗

（1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100；2.重庆出入境检验检疫局，重庆 400020；3.北京中检 维康技术有限公司，北京 100044）

免疫亲和柱-高效液相色谱法测定牛奶中氯霉素和玉米赤霉醇及其类似物

姚 佳1，王 昕1，张建新1,*，李贤良2，郗存显2，王国民2，王 雄3，里 南3，果 旗3

（1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100；2.重庆出入境检验检疫局，重庆 400020；3.北京中检 维康技术有限公司，北京 100044）

建立免疫亲和柱同时净化-高效液相色谱法测定牛奶中氯霉素和玉米赤霉醇及其类似物（α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮和玉米赤霉烯酮）残留量的方法。样品经免疫亲和柱净化与富集后，用高效液相色谱-紫外检测器检测。采用Cloversil-C18反相柱分离，流动相为乙腈-甲醇-水溶液，检测波长为265 nm。结果表明，牛奶中添加氯霉素和玉米赤霉醇及其类似物的回收率在74%～101%，且相对标准偏差均小于7%。氯霉素的检出限为0.02 μg/L，玉米赤霉醇及其类似物的检出限分别为α-玉米赤霉醇0.03 μg/L、β-玉米赤霉醇0.03 μg/L、α-玉米赤霉烯醇0.03 μg/L、β-玉米赤霉烯醇0.03 μg/L、玉米赤霉酮0.04 μg/L和玉米赤霉烯酮0.05 μg/L。该方法灵敏度高、重复性好，提高了检测速率，可满足牛奶样品中痕量氯霉素和玉米赤霉醇及其类似物残留的测定。

牛奶；氯霉素；玉米赤霉醇；免疫亲和柱；高效液相色谱

氯霉素（chloramphenicol，CAP）是一种高效广谱的抗生素，在不同畜禽传染性疾病的治疗中应用广泛，若长期微量摄入CAP就会引起机体菌群失调，还可导致再生障碍性贫血和粒状白细胞缺乏症等疾病[1-3]。玉米赤霉醇（zearalanol，ZER）及其类似物能直接或间接作用于动物脑下垂体和胰脏，提高体内生长激素和胰岛素水平，加速机体蛋白质的合成，提高饲料利用率，从而产生促进增加增畜禽质量的作用，曾作为生长促进剂应用于动物生长。常见主要有α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮和玉米

赤霉烯酮6 种。ZER在畜禽食品中的残留直接影响人类健康，轻则引起人体性机能紊乱，重则影响第二性征的正常发育，甚至可引起癌症[4]。1998年欧盟禁止将玉米赤霉醇等激素类药物应用于畜禽养殖；我国卫生部在2010年明确将玉米赤霉醇列为非食用物质，我国也规定氯霉素和玉米赤霉醇在动物性食品中不得检出[5-8]。

免疫亲和柱（immunoaffinity column，IAC）是基于抗原抗体的具有高度亲和性、专一性和可逆性，将特异性抗体固定在柱体内，选择性吸附样品中的待测物，杂质不被吸附，流出柱外，柱上结合的待测物被特定的洗脱液洗脱下来，直接采用气相色谱（gas chromatography，GC）、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法、酶联免疫反应（enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA）等进行含量测定的一种高效的前处理技术[9]。游丽娜[5]、李贤良[10]等分别比较了采用HLB固相萃取柱、C18固相萃取柱和IAC对鸡蛋样品和猪肉样品的净化效果，以IAC对样品的净化效果最佳，杂质干扰少，化合物响应强度明显提高，且无基质效应。目前有关检测氯霉素和玉米赤霉醇及其类似物的方法有GC、HPLC、ELISA等[11-17]；样品前处理净化技术主要有液-液萃取和固-液萃取[18-20]。这些方法的主要缺陷是操作复杂、耗费大量有毒溶剂，专属性差，且不能实现同时提取净化和富集氯霉素和玉米赤霉醇及其类似物的方法。本实验采用免疫亲和柱同时净化和富集氯霉素和玉米赤霉醇及其类似物，探讨HPLC同时检测氯霉素和玉米赤霉醇及其类似物的色谱条件，建立免疫亲和柱净化-HPLC同时测定牛奶中氯霉素和玉米赤霉醇及其类似物痕量残留含量的方法，为不同食品残留快速检测提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

液态牛奶 市购；乙腈、甲醇（色谱纯） 美国JT Baker公司；氯霉素（CAS：56-75-7）、α-玉米赤霉醇（CAS：26538-44-3）、β-玉米赤霉醇（CAS：26538-44-3）、α-玉米赤霉烯醇（CAS：36455-72-8）、β-玉米赤霉烯醇（CAS：36455-72-8）、玉米赤霉酮（CAS：5975-78-0）和玉米赤霉烯酮（CAS：17924-92-4）标准品（纯度均大于99%） 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

C18色谱柱、IAC-CZ免疫亲和柱（对氯霉素的柱容量为100 ng，对玉米赤霉醇及其类似物的柱容量为500 ng）北京中检维康技术有限公司；LC-10A高效液相色谱系统（配可变波长的紫外检测器） 日本岛津公司；DT5-1台式离心机 北京时代北利离心机有限公司；DCY-125氮吹仪 青岛海科仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制

1.3.1.1 标准储备溶液

CAP标准储备溶液：准确称取10 mg CAP标准品于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至容量瓶刻度，摇匀，配制成100 mg/L的标准储备液，转移至棕色瓶中，贴上标签。ZER单种标准储备溶液：分别称取适量的玉米赤霉醇及其类似物标准品，用甲醇稀释配成100 mg/L的单种标准储备溶液。ZER混合标准储备溶液：分别移取适量ZER单种标准储备溶液，用甲醇稀释成10 mg/L的混合标准储备溶液。标准储备溶液均于4 ℃条件下保存，保存期限6个月。

1.3.1.2 标准工作溶液

CAP标准工作溶液：根据需要用甲醇将CAP标准储备液稀释成适当质量浓度的标准工作液；ZER混合标准工作溶液：根据需要用甲醇将ZER混合标准储备溶液稀释成适当质量浓度的标准工作溶液，标准工作溶液均于4 ℃条件下保存。

1.3.2 样品的测定

取60 mL牛奶样品于4 000 r/min条件下离心10 min，取50 mL下层溶液以2 mL/min的流速通过免疫亲和柱，待溶液全部流出后，用10 mL纯水以2～3 mL/min的流速淋洗亲和柱，将杂质洗去。待溶液全部流出亲和柱后，将玻璃小管置于亲和柱下，用2 mL甲醇以2 mL/min的流速将亲和柱中的氯霉素和玉米赤霉醇及其类似物洗脱下来，所得样品洗脱液收集于玻璃测试管中，于50℃氮气条件下吹至近干，然后用流动相定容至500 μL，注入HPLC仪中进行分析。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：Cloversil ODS-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-甲醇-水（40∶5∶55，V/V）溶液；流速1.0 mL/min；柱温为室温；检测器：紫外检测波长265 nm；进样量20 μL。

2 结果与分析

2.1 色谱条件选择

氯霉素和玉米赤霉醇均可用液相色谱-紫外检测器来进行检测，且两者的检测波长相近（氯霉素检测波长278 nm，玉米赤霉醇检测波长265 nm）。选用265 nm作为检测波长进行检测，包括氯霉素和玉米赤霉醇6 种类似物在内的7 种物质均可被检测到，且分离度较好。

分析氯霉素或玉米赤霉醇常用的有机流动相有甲醇或乙腈，水相流动相为纯水或弱酸（如甲酸或乙酸）水溶液。分析氯霉素常用的流动相多为甲醇-水，分析玉米赤霉醇常用的流动相多为乙腈-水。使用乙腈-水

（40∶60，V/V）溶液作为流动相同时分离氯霉素和6 种玉米赤霉醇及其类似物，可实现基线分离，但整个分析过程需40 min左右；使用乙腈-甲醇-水（40∶5∶55，V/V）溶液作为流动相进行分离，不同物质之间的分离度很好，可获得良好的分离度和峰形，整个分析过程需30 min左右，缩短了分析时间，提高了分析效率，质量浓度100 μg/L的氯霉素和玉米赤霉醇及其类似物的标准溶液色谱图见图1。从图1可知，色谱峰峰形尖锐，对称性好，表明选择的色谱条件可满足分析测定需要。

图1 氯霉素和玉米赤霉醇的标准溶液色谱图 (100 μg/L)Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution of CAP and ZER (100 μg/L)

2.2 样品前处理方法的选择

测定牛奶中氯霉素或玉米赤霉醇常用方法为用乙腈或乙酸乙酯溶剂提取[10,21-25]，但用有机溶剂提取牛奶中的氯霉素和玉米赤霉醇时二者不能同时兼顾，且用有机溶剂进行液-液萃取或固-液萃取操作相对比较步骤繁琐，且费时、费力，影响检测结果的准确性和重复性。

本实验采用牛奶样品直接通过免疫亲和柱进行净化（未出现筛板堵塞现象）的方法，简化了操作步骤，减小了繁琐操作引起的误差，同时避免了使用有机试剂，降低了对环境和人体带来的危害，达到了满意的净化效果，实现了牛奶中氯霉素和玉米赤霉醇及其类似物的同时净化与富集。

图2 牛奶样品添加氯霉素和玉米赤霉醇的色谱图（质量浓度11 μg/L）Fig.2 Chromatogram of milk spiked with mixed standard solution of CAP and ZER (1 μg/L)

由图2可知，在优化的色谱条件下，色谱峰峰形较佳，且无杂质干扰，能满足氯霉素和玉米赤霉醇及其类似物的同时检测要求。

2.3 标准曲线及检出限

分别配制5、10、20、50、100、200、500 μg/L的氯霉素与玉米赤霉醇及其类似物混合标准溶液，在确定的色谱条件下进行测定，以标准溶液质量浓度为横坐标，峰面积响应值为纵坐标绘制标准曲线，得到的线性方程、相关系数及检出限见表1。

表1 混合标准曲线的线性方程、相关系数及检出限Table 1 Linear equations, correlation coefficients and detection limits for seven compounds

以基线噪声3 倍峰面积对应的7 种毒素的含量作为检出限的规则（RSN=3），得到氯霉素的检出限为0.02 μg/L，玉米赤霉醇及其类似物的检出限分别为α-玉米赤霉醇0.03 μg/L、β-玉米赤霉醇0.03 μg/L、α-玉米赤霉烯醇0.03 μg/L、β-玉米赤霉烯醇0.03 μg/L、玉米赤霉酮0.04 μg/L、玉米赤霉烯酮0.05 μg/L。

2.4 精密度

取不含氯霉素和玉米赤霉醇的牛奶样品按照氯霉素1.00 μg/L，玉米赤霉醇及其类似物各2.00 μg/L进行添加，按实验方法连续测定5 次。计算得到上述样品中氯霉素和玉米赤霉醇及其类似物的含量，见表2。

表2 牛奶中氯霉素和玉米赤霉醇的加标回收率和相对标准偏差 (n=5）Table 2 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) for milk spiked with CAP and ZER (n=5）

从表2可以看出，本方法测定氯霉素的相对标准偏差为4.82%；测定6 种玉米赤霉醇及其类似物的相对标准偏差在均6.70%以内，基本满足了定量检测对相对标准偏差的要求。

2.5 准确性

取不含氯霉素和玉米赤霉醇的牛奶样品进行加标回收率实验（三水平添加），结果见表3。

表3 牛奶中氯霉素和玉米赤霉醇回收率Table 3 Recoveries for milk spiked with CAP and ZER

由表3可知，氯霉素的回收率在93%～100%之间，玉米赤霉醇及其类似物回收率在74%～101%之间，说明该方法的准确性良好，能够满足同时测定牛奶中氯霉素和玉米赤霉醇类化合物痕量残留的要求。

3 结 论

建立牛奶中氯霉素和玉米赤霉醇及其类似物共7 种禁用药残留量同时测定的HPLC法。免疫亲和柱作为样品前处理的方法是利用抗原抗体的高度特异性来进行样品的分离纯化与富集的，因此能有效的将干扰物除去。免疫亲和柱的应用简化了牛奶样品前处理的提取、浓缩等操作步骤，同时减少使用有机试剂，降低了对环境和人体带来的危害，实现了牛奶中氯霉素和玉米赤霉醇及其类似物的同时净化与富集。

免疫亲和柱-HPLC测定牛奶中氯霉素和玉米赤霉醇及其类似物方法的检出限分别为氯霉素0.02 μg/L、α-玉米赤霉醇0.03 μg/L、β-玉米赤霉醇0.03 μg/L、α-玉米赤霉烯醇0.03 μg/L、β-玉米赤霉烯醇0.03 μg/L、玉米赤霉酮0.04 μg/L和玉米赤霉烯酮0.05 μg/L。方法的回收率（74%～101%）及重复性（相对标准偏差小于7%）等技术指标均满足国内外相关要求。该方法的检出限满足国内外对上述7 种禁用药物的监控和检测要求，可用于牛奶中这7 种禁用药痕量残留的检测。免疫亲和柱其独特的专一性、高富集率和良好的净化效能，能显著提高检测灵敏度和分析方法的稳定性，且提高了分析效率，应用前景广阔。

[1] 彭涛, 李淑娟, 储晓刚, 等. 高效液相色谱-串联质谱法同时测定虾中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素残留量[J]. 分析化学, 2005, 33(4): 463-466.

[2] BERLINA A N, TARANOVA N A, ZHERDEV A V, et al. Quantum dot-based lateral flow immunoassay for detection of chloramphenicol in milk[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2013, 405(14): 4997-5000.

[3] PAJCHEL G, MICHALSKA K, RAFAŁ G, et al. Assay of the related compounds thiamphenicol, florphenicol, and chloramphenicol by CE[J]. Chromatographia, 2008, 68(7/8): 587-591.

[4] 彭涛, 李晓娟, 陈冬东, 等. 液相色谱-串联质谱法同时测定动物肝脏中玉米赤霉醇及其类似物残留量[J]. 分析化学, 2010, 38(4): 469-474.

[5] 游丽娜, 李贤良, 郗存显, 等. 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法同时检测鸡蛋中6 种玉米赤霉醇及其类似物[J]. 色谱, 2012, 30(10): 1021-1025.

[6] 农业部. 第235号公告 动物性食品中兽药最高残留限量[S].

[7] 刘文卫, 钮伟民, 许伟芳. 氯霉素残留检测技术的研究进展[J]. 现代预防医学, 2007, 34(1): 67-68.

[8] 全国食品安全整顿工作办公室专家组. 食品中可能违法添加的非食用物质名单(第4批)[S].

[9] 谢洁. 免疫亲和柱-高效液相色谱法检测食品中兽药残留[D]. 衡阳:南华大学, 2013.

[10] 李贤良, 游丽娜, 郗存显, 等. 免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱法同时测定猪肉中6 种玉米赤霉醇类化合物残留量[J]. 分析化学, 2013, 41(8): 1147-1152.

[11] LU Yanbin, SHEN Qing, DAI Zhiyuan, et al. Multi-walled carbon nanotubes as solid-phase extraction adsorbent for the ultra-fast determination of chloramphenicol in egg, honey, and milk by fusedcore C18-based high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2010, 398(4): 1819-1826.

[12] ORLOV V Y, LEBEDEV A S. Optimization for the determination of residual levomycetin (chloramphenicol) in cow milk by reversed-phase high-performance liquid chromatography[J]. Journal of Analytical Chemistry, 2013, 68(2): 189-193.

[13] SCHIRMER C, MEISEL H. Chromatographic evaluation of polymers imprinted with analogs of chloramphenicol and application to selective solid-phase extraction[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2009, 394(8): 2249-2255.

[14] 应永飞, 朱聪英, 韦敏珏, 等. 液相色谱-串联质谱法测定饲料中14种霉菌毒素极其类似物[J]. 分析化学, 2010, 38(12): 1759-1764.

[15] 方晓明, 陈家华, 唐毅锋. 高效液相色谱法测定鸡肝中玉米赤霉醇的残留量[J]. 色谱, 2003, 21(2): 158-161.

[16] EVGENIA Y B, IRINA Y G, TATIANA Y R, et al. An immunochemical test for rapid screening of zearalenone and T-2 toxin[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2010, 397(1): 55-62.

[17] JODLBAUER J, ZÖLLNER P, LINDNER W. Determination of zeranol, taleranol, zearalenone, α-and β-zearalenol in urine and tissue by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chromatographia, 2000, 51(11/12): 681-687.

[18] 张岩, 李挥, 张敬轩, 等. 快速高分离液相色谱-串联质谱法测定植物组织中雌激素玉米赤霉醇类化合物[J]. 分析化学, 2009, 37(11): 1683-1686.

[19] 王浩, 刘艳琴, 殷晓燕, 等. 高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱法测定乳品中的氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素残留[J]. 中国食品学报, 2008, 8(5): 138-141.

[20] 刘吉成. HPLC-MS/MS测定猪肉和猪肝中氯霉素残留量的研究[J].食品与机械, 2012, 28(4): 93-95.

[21] 欧阳立群, 吴富忠. 水产品中氯霉素残留量的高效液相色谱测定方法[J]. 中国卫生检验杂志, 2005, 15(2): 178.

[22] 谢守新, 林海丹, 秦燕, 等. 液相色谱-电喷雾串联质谱内标法测定水产品中氯霉素药物残留[J]. 中国卫生检验杂志, 2006, 16(11): 1298-1300.

[23] 张清杰, 谢洁, 果旗, 等. 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法检测乳制品中玉米赤霉醇及其类似物[J]. 中国乳品工业, 2011, 39(12): 34-35.

[24] 谢文, 丁慧瑛, 黄雷芳, 等. 高效液相色谱-电喷雾电离三极四极杆质谱检测动物源食品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考残留量[J]. 分析试验室, 2006, 25(12): 1-7.

[25] 赖世云, 陶保华, 傅士姗, 等. 液相色谱-质谱联用测定乳及乳制品中29 种性激素[J]. 分析化学, 2012, 40(1): 135-139.

Simultaneous Determination of Residues of Chloramphenicol, Zearalanol and Its Analogs in Milk by High Performance Liquid Chromatography with Immunoaffinity Column

YAO Jia1, WANG Xin1, ZHANG Jian-xin1,*, LI Xian-liang2, XI Cun-xian2, WANG Guo-min2, WANG Xiong3, LI Nan3, GUO Qi3
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A & F University, Yangling 712100, China; 2. Chongqing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Chongqing 400020, China; 3. Clover Technology Group Inc., Beijing 100044, China)

An immunoaffinity column cleanup-high performance liquid chromatography (HPLC) method was established for the simultaneous determination of residues of chloramphenicol, zearalanol and its analogs (α-zeranol, β-zeranol, α-zearalenol, β-zearalenol, zearalanone, and zearalenone) in milk. Samples were cleaned up and enriched on an immunoaffinity column. The chromatographic separation was performed on a Cloversil-C18column using acetonitrile-methanol-water as the mobile phase and ultraviolet (UV) detection was performed at 265 nm. The recoveries of seven target compounds at different spiked levels ranged from 74% to 101% and the relative standard deviations were less than 7%. The limits of detection were 0.02 μg/L for chloramphenicol, 0.03 μg/L for α-zearalanol, β-zearalanol, α-zearalenol, and β-zearalenol, 0.04 μg/L for zearalanone, and 0.05 μg/L for zearalenone. The proposed method is efficient, stable, reliable and accurate, and can be used for the determination of trace residues of chloramphenicol, zearalanol and its analogs in milk.

milk; chloramphenicol; zearalanol; immunoaffinity column; high performance liquid chromatography (HPLC)

TS207.5；R155.5

A

1002-6630（2014）18-0124-04

10.7506/spkx1002-6630-201418025

2014-01-03

国家质量监督检验检疫局公益性行业科研专项（201210086）

姚佳（1990—），女，硕士研究生，主要从事食品安全检测技术研究。E-mail：yaojia083@163.com

*通信作者：张建新（1959—），男，教授，硕士，主要从事食品营养安全与标准化研究。E-mail：zhangjx59@foxmail.com