血浆miR－21和miR－133a在缺血性心肌病中的表达水平及临床价值研究

贺付成，吕 品，赵 雪，王 玺

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度为18～25 nt的内源性单链RNA，可通过降解靶mRNA或抑制其翻译过程来负向调控基因的表达和蛋白的合成，参与多种病理、生理过程［1］。最新研究显示，在不同疾病及病理状态下一些miRNAs的改变可稳定、特异地反映在血清或血浆中［1－2］。miRNA可通过分子生物学方法进行扩增及测定，并作为生物标志物用于多种疾病的诊断、预后判断等研究［3］。有报道显示，miR－21在心肌肥大、心肌缺血及纤维化引起的心脏重构中表达升高，并可调控心肌梗死后血管再生及心肌缺血再灌注引起的心肌细胞凋亡等多种心血管病理过程［4－6］。miR－133a在缺血性心力衰竭、大鼠急性心肌缺血再灌注损伤模型及心肌肥厚病理模型中表达均降低［7－9］，但作为心脏含量最丰富的miRNAs之一，其在急性冠脉综合征引起的心肌损伤患者血浆中表达水平升高［10－11］。本研究旨在观察缺血性心肌病 (ICM)患者血浆中miR－21和miR－133a的表达水平，并探索其在ICM病理生理机制中的意义，为揭示miRNAs在ICM临床诊疗中的价值提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2012年9月—2013年5月在郑州大学第一附属医院确诊为ICM的患者48例为ICM组，另选择该院健康志愿者30例为对照组。ICM的诊断参照2010年美国心脏协会 (AHA)和美国心脏病学会(ACC)发布的心血管病诊疗指南［12］。入选标准:(1)美国纽约心脏病协会 (NYHA)心功能分级Ⅲ级或Ⅳ级;(2)冠状动脉造影至少1支主要冠状动脉及其分支存在≥50%狭窄性病变;(3)心脏明显扩大及左心室射血分数 (LVEF)≤40%。排除标准:(1)冠心病及其并发症 (室间隔穿孔、乳头肌功能不全等);(2)其他心脏病引起的心脏扩大和心力衰竭 (原发性心肌病、风湿性心肌病、甲状腺功能亢进等);(3)ICM病史不明、恶性肿瘤、急慢性感染、脑血管疾病、自身免疫性疾病、血液系统疾病、严重肝肾功能不全。所有研究对象有知情同意权并经伦理委员会同意。

1.2 主要试剂及仪器 RNA提取试剂TRI Reagent BD(美国MRC Gene公司产);RT反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒 (日本TAKARA公司产);Nano-Drop2000c紫外分光光度计 (美国赛默飞世尔公司产);7500 Fast Real－Time PCR仪 (美国ABI公司产);罗氏C8000全自动生化分析仪 (包括罗氏电化学发光试剂盒和罗氏酶比色法试剂盒)。

1.3 标本收集及常规检测指标 ICM患者入院后于次日 (＞12 h)晨时采集空腹肘静脉血4 ml，采用罗氏酶比色法试剂盒测定血脂谱〔总胆固醇 (TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇 (LDL－C)及高密度脂蛋白胆固醇 (HDL－C)〕、罗氏电化学发光试剂盒测定N末端B型脑钠肽原 (NT－proBNP)水平，并留取空腹静脉血3 ml置于乙二胺四乙酸二钾 (EDTA－K2)抗凝管中，冰箱4℃保存待测血脂指标。左心室舒张末期容积 (LVEDV)、LVEF于我院超声科用心脏彩超检测。

1.4 实时荧光定量聚合酶链式反应法 (qRT－PCR)测定血浆中miR－21和miR－133a水平 取全血标本3 000×g离心10 min，将血浆转移至1.5 ml离心管中，再以12 000×g离心10 min，取200 μl血浆，用TRI Reagent BD试剂提取总RNA。NanoDrop2000c紫外分光光度计检测总RNA的水平和纯度。选取吸光度比值为1.8～2.1的样品用于后续试验;按RT反转录试剂盒说明书操作将RNA反转录为cDNA。引物设计与合成由广州锐博公司完成。qRT－PCR总反应体系为20 μl，包括:SYBR ® Premix Ex Taq Ⅱ (2 ×)10 μl，10 μmol/L 上、下游引物各0.8 μl，ROX Reference DyeⅡ (50×)0.4 μl，cDNA 模板 2 μl，ddH2O 6 μl;循环参数:95 ℃ 30 s，95℃ 3 s，60℃ 30 s，共40个循环。以U6为内参基因，用7500 Fast System SDS软件计算Ct值，血浆miR －21和miR －133a的相对表达量用 2－ΔΔCt法计算［13］。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行分析，正态分布计量资料以 ()表示，组间比较采用两独立样本t检验;非正态分布计量资料以中位数 (四分位数间距)〔M(QR)〕表示，组间比较采用Mann－Whitney U检验;计数资料采用χ2检验;连续、线性、正态分布数据采用Pearson相关分析，非正态或等级资料采用Spearman秩相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组临床资料比较 ICM组与对照组的性别、年龄、吸烟与否、是否患有糖尿病比较，差异均无统计学意义 (P＞0.05);而在是否行经皮冠状动脉介入术(PCI)方面比较，差异有统计学意义 (P＜0.05，见表1)，两组具有较好的可比性。

表1 两组临床资料比较Table 1 Comparison of clinical data between the two groups

2.2 实验室检查指标比较 ICM组LDL－C、HDL－C及LVEF低于对照组，TG、NT－proBNP及LVEDV高于对照组，差异均有统计学意义 (P＜0.05);而两组的舒张压、收缩压及TC比较，差异均无统计学意义 (P＞0.05，见表2)。

2.3 血浆miR－21和miR－133a的表达水平 ICM组血浆miR－21、miR－133a水平 〔(8.10±2.93)、 (3.28±1.62)〕均高于对照组 〔(4.22±1.78)、 (1.37±2.84)〕，差异有统计学意义 (t=－7.615、－6.98，P＜0.05)。

2.4 相关性分析 (1)Pearson和Spearman秩相关分析:ICM组血浆miR－21水平与LVEDV、NT－proBNP呈正相关关系 (P＜0.05)，而与年龄、LVEF、TC、TG、LDL－C、HDL－C无直线相关性 (P＞0.05);ICM患者血浆miR－133a水平与年龄、LVEDV、LVEF、TC、TG、LDL－C、HDL－C及NT－proBNP均无直线相关性 (P＞0.05，见表3)。 (2)偏相关分析:调整年龄、性别、吸烟史、糖尿病、高血压及NT－proBNP水平等因素后，ICM组中血浆miR－21水平仍与LVEDV呈正相关关系 (r=0.334，P＜0.05)。

表2 两组实验室检查指标的比较Table 2 Comparison of laboratory parameters between the two groups

表3 ICM组miR－21和miR－133a与各指标的相关性分析Table 3 Correlation of miR－21，miR－133a and laboratory parameters

3 讨论

miRNAs是一类由非编码区转录产生的单链小分子RNA，由于其广泛存在于动植物中，并可通过对相应靶基因的调控参与众多病理、生理过程，使其自1993年由Lee等首次报道后，迅速成为众多领域的研究热点。已有大量研究表明，miRNAs在不同疾病及病理进程中具有特定的表达谱，并可稳定表达于外周循环血液中，这些特点使miRNAs可作为肿瘤、自身免疫性疾病、炎症等多种疾病诊断及预后判断的重要生物标志物［1－3］。miRNAs在心血管疾病诊疗中的作用也逐渐受到人们的重视。

ICM是由于冠状动脉狭窄闭塞，长期慢性心肌缺血而导致的严重心肌功能障碍性疾病。长期心肌缺血可造成心肌细胞坏死、凋亡，心肌顿抑或心肌冬眠，继而引起心肌细胞数量减少、纤维组织增多以及病理性心室重构。其潜在的严重心脑血管并发症 (如心力衰竭和卒中)一直是人们关注和研究的焦点，而miRNAs类内源性因子在ICM中的作用及机制尚未系统阐明。已有研究显示，多种miRNAs与ICM的发生、发展相关，如miR－126、miR －130a等［14］。但对 ICM 患者循环 miRNAs表达谱的变化及其作为ICM诊断及风险评估指标的研究较少。Qin等［4］发现miR－21可减少心肌缺血再灌注引起的心肌细胞凋亡继而减缓心室重构进程。miR－21在心肌肥大、心肌缺血及纤维化引起的心脏重构中也具有重要的调控作用［5－6］。miR －133a在心脏中含量较丰富，并广泛参与心肌细胞的分化、增殖等心脏发育过程［9］。在 Danowski等［7］的研究发现，冠状动脉旁路移植术后患者心肌组织中miR－133a表达水平与心力衰竭严重程度呈负相关，miR－133a表达水平越低，心功能分级及肺动脉压越高。心肌缺血后适应可减少缺血再灌注损伤引起的心肌细胞凋亡、改善心功能。缺血后适应处理的心肌组织中miR－133a表达水平升高，提示miR－133a可能与缺血后适应引起的心肌保护机制有关［8］。最新研究显示，急性冠脉综合征患者外周循环血液中miR－133a水平升高，可作为心肌损伤诊断及判断预后的标志物［10－11］。本研究发现，ICM 组LDL－C、HDL－C及 LVEF低于对照组，TG、NT－proBNP及LVEDV高于对照组，提示ICM患者存在血脂异常及心脏重构。同时本研究采用qRT－PCR检测ICM患者血浆miR－21、miR－133a的表达水平，结果显示血浆miR－21、miR－133a水平在ICM患者中显著升高;相关性分析显示，ICM患者血浆miR－21水平与NT－proBNP、LVEDV呈正相关关系，且在调整了各ICM相关危险因素 (如性别、年龄、高血压、吸烟史、糖尿病、LVEF及NT－proBNP等)后，血浆miR－21水平仍与LVEDV呈正相关，提示血浆miR－21可能参与了ICM患者心室重构，可作为ICM患者心室解剖重构标志物，与现有miR－21可调控心室重构进程等研究结果具有一致性。研究中ICM患者血浆miR－133a水平高于对照组，结合国内外研究推测可能与ICM患者存在冠状动脉损伤及心肌缺血有关。但本研究未发现miR－133a与ICM患者心室重构相关指标具有直线相关性，其是否参与了心室重构的进程尚需进一步研究。

综上所述，本研究的意义在于发现了ICM患者血浆miR－21、miR－133a水平升高，可作为ICM诊断及进行风险评估的新的生物标志物。但本研究尚存在局限性，如样本量不足、ICM类型转变等;另外，ICM患者的基础疾病如糖尿病、高血压等是否会对血浆miR－21及miR－133a的水平产生影响尚不清楚，仍需扩大样本量进一步明确血浆miR－21及miR－133a作为ICM诊断及风险评估生物标志物的临床意义和价值。

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