响应面法优化金针菇废弃菌根的蛋白提取工艺研究

张 乐，周林燕，宋洪波，李 鹏，李亚茹，曹珍珍，魏 明，李淑荣，*

（1.中国农业科学院农产品加工研究所/农业部农产品加工综合性重点实验室，北京100193；2.福建农林大学食品科学学院，福建福州350002）

响应面法优化金针菇废弃菌根的蛋白提取工艺研究

张 乐1，2，周林燕1，宋洪波2，李 鹏2，李亚茹1，曹珍珍1，魏 明1，2，李淑荣1，*

（1.中国农业科学院农产品加工研究所/农业部农产品加工综合性重点实验室，北京100193；2.福建农林大学食品科学学院，福建福州350002）

以废弃的金针菇菌根为原料，将其制备成颗粒度为100目的粉末，以0.14mol/L NaCl溶液为提取液，采用2次提取的方法提取蛋白；在单因素实验的基础上，确定具有显著影响的料液比、提取温度、时间、pH为自变量，菌根蛋白提取率为响应值，利用Box-Behnken实验设计方案和响应面分析法，建立总蛋白提取率的二次回归模型，确定了影响提取率的因素依次为料液比＞pH＞时间＞温度。优化得到的最佳提取条件为：料液比1∶16g/mL、温度30℃、时间30min、pH10，在此条件下蛋白提取率预测值为64.75%，验证实验中蛋白的得率为64.91%，相对偏差0.25%。

金针菇，蛋白，提取，响应面法

金针菇学名毛柄金钱菌（Flammulina velutipes），又名枸菇、冬菇、朴菇等。金针菇具有丰富的营养成分，其精氨酸和赖氨酸等人体必需氨基酸的含量高于其他菇类，能有效增进幼儿身高、体重和智力的发育，因此金针菇被誉为“增智菇”[1-3]。金针菇中还含有多糖、火菇素、倍半萜、免疫调节蛋白、核糖体失活蛋白等多种生物活性物质，这些活性成分具有很高的药用价值，具有抑制过敏反应、抗氧化、抗疲劳、提高记忆力、减缓细胞衰老、延年益寿等功效[4-6]。

我国是食用菌生产大国，位居世界之首，占全球总产量的70%以上。随着人们对食用菌消费量的提高，金针菇的产销量逐年上升[7]。金针菇在采收和加工过程中，产生大量的菌柄、菌盖、畸形菇、劣质菇等下脚料，目前少数以低价进入市场或烤制成干菇，多数未经处理而直接丢弃，而靠于基部的菌根由于其杂质多、口感差被切下来直接被当作垃圾扔掉，但这些下脚料中仍然含有大量的蛋白质、纤维素等营养成分和活性成分。学者们的研究表明，金针菇菌根和上面部分子实体的主要营养成分种类相似，并且菌根中的蛋白质含量为18%～25%，含量较高[8-9]。本论文以金针菇接近培养基部分的废弃菌根为原料，研究影响菌根蛋白浸提率的因素，并利用响应面分析法进行提取工艺优化，获得最佳工艺参数。通过本研究能有效提高金针菇副产物和下脚料的价值，减少其对环境的污染，有效增加农户的经济效益。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金针菇 北京市天秀路菜市场；NaCl、NaOH、盐酸等 国药化学试剂有限公司，分析纯；牛血清蛋白、考马斯亮蓝G-250 美国Sigma公司。

DHP-9140A电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；SL-100型高速多功能粉碎机 浙江省永康市松青五金厂；pB-10 sartorius普及型pH计 美国赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；HH-4数显恒温水浴锅 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；GL-20G-Ⅱ型高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；全自动凯氏定氮仪 丹麦FOSS公司；TU-1901双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 金针菇菌根粉末的制备 将金针菇清理去杂后把上部子实体和菌根切分，菌根放入电热鼓风干燥箱50℃烘至恒重，万能粉碎机粉碎，贮于干燥器备用。经测定此菌根粉水分含量为6.5%。

1.2.2 金针菇菌根蛋白的提取 称取已制备好的金针菇菌根粉，按一定的液料比加入提取剂，在一定温度和pH下水浴提取一定时间后，8000r/min离心20min，取上清液，考马斯亮蓝法测蛋白含量。

1.2.3 牛血清白蛋白标准曲线的绘制 准确称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100mL，配制成100μg/mL的牛血清白蛋白标准溶液，分别取出0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于6支具塞试管，分别加水补足到1mL，然后各加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂盖上塞子，摇匀，室温静置2min后在595nm波长下比色测定。以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线，得回归方程Y= 0.0063X+0.0055，相关系数R2=0.9973。

1.2.4 指标的测定 菌根蛋白提取率的计算：蛋白提取率（%）=（上清液中蛋白质量/菌根粉中总蛋白质量）×100；菌根粉总蛋白测定采用凯氏定氮法（GB/T 15673-2009）；提取液蛋白的测定采用考马斯亮蓝G-250法[10-11]。水分含量测定采用直接干燥法（GB5009.3-2010）。

1.2.5 单因素实验设计

1.2.5.1 提取剂对菌根蛋白提取率的影响 取粉末样品按料液比1∶15（g/mL）加入三角瓶中，提取试剂分别为蒸馏水、0.14mol/L NaCl溶液和0.01mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液（PBS），35℃水浴1h。比较水提法、盐提法、缓冲液提取法对菌根蛋白提取效果的影响。

1.2.5.2 颗粒度对菌根蛋白提取率的影响 取颗粒度分别为40、60、80、100、120、150目金针菇菌根粉末，以料液比1∶15g/mL，0.14mol/L NaCl为提取液，调pH10，置于40℃水浴，提取60min。

1.2.5.3 料液比对菌根蛋白提取率的影响 取颗粒度100目的金针菇菌根粉末，0.14mol/L NaCl为提取液，调pH10，水浴温度40℃，提取时间60min的条件下，研究1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25g/mL等料液比对菌根蛋白提取率的影响。

1.2.5.4 提取温度对菌根蛋白提取率的影响 取颗粒度100目的金针菇菌根粉末，料液比1∶15（g/mL），0.14mol/L NaCl溶液为提取液，调pH10，分别置于冰箱（4℃），室温（20℃），30、40、50℃水浴条件下，提取60min。

1.2.5.5 提取时间对菌根蛋白提取率的影响 取颗粒度100目的金针菇菌根粉末，料液比1∶15g/mL，0.14mol/L NaCl溶液为提取液，调pH10，分别在40℃水浴中提取0、10、20、30、40、50、60、90min。

1.2.5.6 pH对菌根蛋白提取率的影响 取颗粒度100目的金针菇菌根粉末，料液比1∶15（g/mL），0.14mol/L NaCl溶液为提取液，40℃水浴中提取60min条件下，pH分别调为8、9、10、11、12。

1.2.5.7 提取次数对菌根蛋白提取率的影响 一次浸提并不能将菌根中的蛋白完全提取出，将第1次浸提后的残渣继续进行蛋白提取，提取条件和第1次浸提的相同，以此类推进行第2次、第3次、第4次所得滤液合并，分别测定其蛋白含量。

1.2.6 响应面实验设计 在单因素实验基础上，确定样品颗粒度100目为实验材料，以稀盐（0.14mol/L NaCl溶液）为提取液，提取次数为2次，在此条件下选择有显著影响的料液比、提取温度、时间、pH为自变量，菌根蛋白提取率为响应值（Y），采用Box-Behnken的中心组合实验设计原理，采用四因素三水平的响应面分析法[12]，建立菌根蛋白质提取率的二次多项式数学模型。自变量因素及编码水平见表1。

表1 实验因素水平及编码Table.1 Variables and experimental design levels for response surface

1.3 数据分析

采用Origin8.0数据处理软件和Design-Expert. 8.05b软件进行数据分析处理和绘图。

2 结果与分析

2.1 菌根蛋白提取率影响因素的研究

2.1.1 提取剂对菌根蛋白提取率的影响 水提法、盐提法、缓冲液提取法对菌丝体蛋白提取效果的影响实验结果见图1。分析图1可以看出，稀盐（0.14mol/L NaCl溶液）的提取效果最好，缓冲液次之，直接水提法的提取率最低。数据分析结果表明，三种试剂的提取效果的差异极显著（p＜0.01）。原因在于稀浓度盐可促进蛋白质盐溶，并且盐离子与蛋白质部分结合，能够保护蛋白质不易变性。因此，选择稀盐（0.14mol/L NaCl溶液）为提取试剂。

图1 提取试剂对蛋白质提取率的影响Fig.1 Effect of extraction reagent on extraction rate of protein

2.1.2 颗粒度对菌根蛋白提取率的影响 不同颗粒度对菌根蛋白提取率影响的实验结果见图2。由图2可以看出，随着粉碎度的增加，蛋白提取率明显增加；当粉碎度大于100目后，增长趋势平缓。可见，粉碎处理会破坏金针菇的细胞壁，有利于细胞内有效成分的提取。但是，100、120、150目之间的蛋白提取率无显著差异（p＞0.05），考虑到粉碎过细会造成产品的提取率提高不明显，因此，选择100目为适宜的颗粒度。

图2 颗粒度对菌根蛋白提取率的影响Fig.2 Effect of degree of grinding on extraction rate of protein

2.1.3 料液比对菌根蛋白提取率的影响 不同料液比对蛋白提取率的影响实验结果见图3。分析图3可以看出，随着料液比的增加，蛋白的提取率增加，但料液比达1∶15以后提取率增幅较小，各处理间无显著差异（p＞0.05）。较低的物料浓度有助于质量扩散作用的增强，但液料比过大会造成溶剂和能源的浪费，且会给浓缩过程带来负担[13]。因此，选择料液比1∶15进行下一步实验。

图3 料液比对蛋白提取率的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of protein

2.1.4 提取温度对菌根蛋白提取率的影响 不同提取温度对蛋白提取率的影响实验结果见图4。分析图4可以看出，菌根蛋白的提取率随着提取温度的升高而增大，在30℃时达到最大；此后，随温度上升提取率反而下降。在提取温度升高过程中，分子之间热运动加剧，促使提取过程中传质速率上升，提取速率加快；但温度过高，可能引起蛋白质的聚集和沉淀，使其溶解度下降，从而降低了蛋白提取率[14]。

图4 提取温度对蛋白质提取率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on the Protein extraction rate

2.1.5 提取时间对菌根蛋白提取率的影响 不同提取时间对蛋白提取率的影响实验结果见图5。分析图5可以看出，随着提取时间的延长，蛋白提取率逐渐增大，在30min时提取率达最大，此后延长时间提取率呈下降趋势，可能是因随时间延长导致蛋白变性，使提取率呈下降趋势[15]。

图5 提取时间对蛋白质提取率的影响Fig.5 Effect of extraction time on the Protein extraction rate

2.1.6 pH对菌根蛋白提取率的影响 不同pH对蛋白提取率的影响实验结果见图6。分析图6可以看出，随着提取液pH的升高，蛋白质提取率增大，当pH8～10之间蛋白质提取率明显增加（p＜0.05）；当pH大于10后蛋白质提取率增加缓慢，各处理间无显著差异（p＞0.05）。随着pH的增加，蛋白质-水相互作用增强，溶解性提高。研究表明，过强的碱性会引起脱氨、脱羧、肽键断裂，引起胱赖反应，将氨基酸转变为有毒化合物，同时氨基酸之间有可能发生缩合反应产生异味[16]。

图6 提取液pH对蛋白质提取率的影响Fig.6 Effect of extracting solution pH value on Protein extraction rate

2.1.7 提取次数对菌根蛋白提取率的影响 不同提取次数对菌根蛋白的影响实验结果如图7所示。由图7可知，二次提取后蛋白提取率明显大于第1次（p＜0.05），且第2、3、4次之间没有显著性差异（p＞0.05）。这可能与菌根中水溶性蛋白在二次提取后基本浸出，提取剂蛋白质浓度处于平衡有关，故选择提取次数为2次。

2.2 响应面实验设计分析及提取工艺的优化

2.2.1 二次回归方程数学模型的建立 固定0.14mol/L NaCl溶液为提取剂、颗粒度100目、提取次数为2次。以有显著影响的料液比、提取温度、时间、pH为自变量，菌根蛋白提取率为响应值（Y），响应曲面实验设计和实验结果见表2。

采用Design Expert 8.05数据分析软件对表中的实验结果进行回归分析，得到金针菇蛋白提取率与料液比（A）、提取温度（B）、提取时间（C）和pH（D）4个因素的数学回归模型如下：

Y=63.96+4.03A+0.032B-0.041C+0.52D+0.67AB+ 0.32AC+1.58AD+3.60BC-1.32BD-2.20CD-5.58A2-4.64B2-6.11C2-4.63D2。对此回归模型进行方差分析，结果如表3所示。

由表3可知，该模型的F=11.54，p＜0.0001，表明回归模型极显著；失拟项的F值为0.17，说明失拟项相对于误差项来讲不显著；决定系数R2为0.9203，说明该模型的拟合性较好，可以用此模型对蛋白的提取率进行分析和预测。

2.2.2 交互作用分析 由表3还可以看出，A、BC、A2、 B2、C2、D2对蛋白质提取率影响显著。由F检验可以得到因子贡献率为：A＞D＞C＞B，即：料液比＞pH＞时间＞温度。

表2 响应曲面实验设计及结果Table.2 Experimental designs and extraction results

方差分析结果表明，AB、AC、AD、BD、CD无明显的交互作用，BC的交互作用显著，即温度和时间之间的交互作用对蛋白提取率有显著影响，其交互作用响应曲面如图8所示。

从图8可以看出，当提取时间一定时，提取温度在25℃至35℃之间，蛋白的提取率先是显著增大，达到最大值后又开始慢慢减小；当提取温度一定时，提取时间在20min至40min之间，蛋白提取率先是渐渐增大，达到最大之后又开始慢慢减小。

2.2.3 回归模型验证 由Design-Expert.8.05b分析软件对实验模型进行典型性分析结果表明，提取蛋白的最佳条件为料液比1∶16.14、温度30.04℃、时间29.87min、pH10.12，蛋白提取率的理论值为64.75%。考虑到实际操作，将蛋白提取条件修正为料液比1∶16、温度30℃、时间30min、pH10，实测提取率为64.91%，相对偏差0.25%，可见该模型能较好地反映蛋白质提取条件。

表3 回归模型的方差分析Table.3 ANOVA for response surface quadratic model

图8 提取温度和时间交互影响蛋白质提取率的曲面图Fig.8 Response surface plot of the effect of operating temperature and time and their mutual interactions on the extraction rate of protein

3 结论

本实验对影响金针菇菌根蛋白提取的因素：提取试剂、颗粒度、料液比、提取温度、时间、pH、提取次数进行了研究，在此基础上选择有显著影响的四个因素，利用Box-Behnken实验设计方案和响应面分析建立了回归方程。由F检验得到因子贡献率为料液比＞pH＞时间＞温度。利用优化模型得到最佳提取条件为：料液比1∶16g/mL、温度30℃、时间30min、pH10，实际提取率可达为64.91%，与理论值64.75%相对偏差为0.25%，证实了该模型的可行性，为金针菇菌根蛋白的提取提供了理论依据。

金针菇废弃菌根具有很大的开发潜力，国内外学者对金针菇功能成分提取的研究主要集中在子实体上。因此，为了充分开发利用金针菇废弃菌根，有效提高金针菇副产物和下脚料的价值仍需加大科研力度，完善蛋白提取分离基本理论和方法，满足工业产业化生产的要求。

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Optimization of extraction of protein from base of Flammulina velutipes using response surface methodology

ZHANG Le1，2，ZHOU Lin-yan1，SONG Hong-bo2，LI-Peng2，LI Ya-ru1，CAO Zhen-zhen1，WEI-Ming1，2，LI Shu-rong1，*
（1.Key Laboratory of Agro-product Processing and Quality Control/Institute of Agro-Products Processing Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China；2.College of Food Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China）

In this study，extraction of proteins from base of Flammulina velutipes was investigated.Materials were crushed into 100 mesh powders，and 0.14mol/L NaCl buffer was used to extract for twice.Based on single factor experiments，solid-liquid ratio，extraction temperature，extraction time，and extraction pH were optimized using Box-Behnken design and response surface methodology for achieving maximum extraction rate of proteins.Factor contribution rate obtained from the F-test were as follows：solid-liquid ratio＞extraction pH＞extraction time＞extraction temperature.The optimum extraction parameters obtained from response surface analysis were as follows：solid-liquid ratio 1∶16g/mL，extraction temperature 30℃，extraction time 30min，and extraction pH10.Under the optimized conditions，the predicated extraction rate of proteins was 64.75%，meanwhile the rate of proteins was 64.91%in the validated experiment with the relative deviation value of 0.25%.

Flammulina velutipes；protein；extraction；the response surface methodology

TS201.1

B

1002-0306（2014）06-0221-05

2013－08－02 *通讯联系人

张乐（1987-），女，硕士研究生，研究方向：食品加工理论与应用。

公益性行业（农业）科研专项（201303080）。