烟草及烟草制品中霉菌数量检验用培养基的开发与应用

林华清，曾令杰，王嘉乐，沙云菲，戚大伟，吴达

上海烟草集团有限责任公司，上海市杨浦区长阳路717号 200082

烟草及烟草制品中霉菌数量检验用培养基的开发与应用

林华清，曾令杰，王嘉乐，沙云菲，戚大伟，吴达*

上海烟草集团有限责任公司，上海市杨浦区长阳路717号 200082

为开发适用于烟草及烟草制品中霉菌数量检验用的培养基，以烟草及烟草制品中8种常见的污染霉菌（黄曲霉、黑曲霉、局限曲霉、桔青霉、产黄青霉、总状毛霉、匍枝根霉和绿色木霉）为试验菌种，采用5种常见的霉菌培养基（孟加拉红琼脂、察氏琼脂、高盐察氏琼脂、含20%蔗糖的高渗察氏琼脂和马铃薯葡萄糖琼脂培养基）及4种研发的新型培养基进行烟草及烟草制品中霉菌数量检验用培养基的初筛和复筛研究。结果表明：与其他培养基相比，Ⅰ号改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基（马铃薯200 g，葡萄糖20.0 g，NaCl 30.0 g，琼脂16.0 g，氯霉素0.1 g和蒸馏水1000 mL）具有检验霉菌菌相全面、获得霉菌数量结果准确等优点，适用于烟草及烟草制品中霉菌数量的检测。

烟草；烟草制品；霉菌数量检验；培养基

烟草及烟草制品中含有霉菌生长所需的各种营养物，一旦温度、湿度等环境条件适宜，各种霉菌极易滋生，进而导致烟草及烟草制品发霉变质，直接影响烟草及其制品的外观和香味品质，降低其使用价值，给烟草业带来重大损失［1］。近年来，关于烟草霉变方面的研究较多，如霉变机制［2］、储藏条件对烟草霉变的影响［3］、优势霉菌的分离鉴定和防霉剂筛选［4］等。为及时了解烟草及其制品中的霉菌数量，减少霉变造成的损失，建立合适的霉菌检测方法是非常必要的。尽管食品行业等检验霉菌的方法与培养基较为成熟，对建立烟草行业霉菌检验方法有一定的参考价值，研究人员也主要是参考广泛应用于食品、化妆品和土壤等样品中霉菌数量检验用的培养基，如孟加拉红琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂、察氏琼脂和含20%蔗糖的高渗察氏琼脂培养基等对烟草及其制品中的霉菌数量进行分析［5-9］，但由于不同类型的烟草样品中霉菌的种类存有差异，且各种霉菌对培养基中营养成分的需求也不同，分析结果的准确性难以保证，相关研究有待进一步深入。因此，针对烟草及烟草制品中8种常见霉菌（黄曲霉、黑曲霉、局限曲霉、桔青霉、产黄青霉、总状毛霉、匍枝根霉和绿色木霉）的营养需求及生理特性，对霉菌数量检验用培养基进行了筛选，旨在研制适用于烟草及烟草制品中霉菌数量检验用的培养基。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

8种菌种：黄曲霉（Aspergillus flavus）、黑曲霉（A. niger ATCC16404）、局限曲霉（A.restrictus CGMCC 3.3973）、桔青霉（Penicillium citrinum）、产黄青霉（P. chrysogenum）、总状毛霉（Mucor racemosus CGMCC 3.206）、匍枝根霉（Rhizopus stolonifer CGMCC 3.2045）和绿色木霉（Trichoderma viride）。6种烟草及烟草制品，其中烟草样品4种：香料烟A（表观正常），香料烟B（人工霉变），烤烟A（自然霉变）和烤烟B（表观正常）；市售成品卷烟2种：“红双喜（12 mg）”和“中南海（8 mg）”。

培养基：孟加拉红琼脂培养基［10］；察氏琼脂培养基［8］；高盐察氏琼脂培养基［11］；含20%蔗糖的高渗察氏琼脂培养基［8］；马铃薯葡萄糖琼脂培养基［10］；Ⅰ～Ⅳ号改良的马铃薯葡萄糖琼脂培养基（以下简称Ⅰ～Ⅳ号改良培养基）。Ⅰ号改良培养基配方：马铃薯（市售，去皮切块）200 g，葡萄糖20.0 g，NaCl 30.0 g，琼脂16.0 g，氯霉素0.1 g，蒸馏水1000 mL。Ⅱ～Ⅳ改良培养基配方中除NaCl用量分别调整为40.0，50.0和60.0 g外，其余成分用量同Ⅰ号改良培养基。无菌蒸馏水（蒸馏水分装后，121℃下灭菌20 min）。

葡萄糖（AR，国药集团化学试剂有限公司）；NaCl（AR，上海大合化学品有限公司）；10%氯霉素（上海盛思生化科技有限公司）；琼脂［细菌培养级，凝胶强度(1.5%)≥1200 g/cm2；上海日出生物科技有限公司］。

BagMixer 400拍击式均质器、Bagfilter均质袋（法国Interscience公司）；E100显微镜（日本Nikon公司）；SE402F型电子天平［感量：0.01 g，奥豪斯仪器(上海)有限公司］；PYX-DHS-50×65-BS-Ⅱ型隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）。

1.2 方法

1.2.1 烟草及烟草制品中霉菌数量检验用培养基的初筛

以烟草及烟草制品中常见的8种污染霉菌为试验菌［5-8,10］，并选择5种常用的霉菌培养基作候选培养基［6-9,11-12］，采用霉菌三点接种法接种，经28℃培养6～9 d后，观察各试验菌在5种培养基上的生长情况。

采用上述方法对设计的Ⅰ～Ⅳ号改良培养基进行初筛。

1.2.2 烟草及烟草制品中霉菌数量检验用培养基的复筛

选用总状毛霉、产黄青霉和局限曲霉3种常见霉菌，分别制备孢子液，步骤如下：用适量无菌蒸馏水将霉菌斜面菌种的孢子洗至含无菌玻璃珠的三角瓶中，充分振摇；再加入适量无菌蒸馏水并充分振摇，用含无菌擦镜纸的过滤器过滤；滤液采用菌落计数法进行活菌计数，根据实验需要调节成一定浓度。

将上述制备的3种霉菌孢子液制成霉菌混合孢子液。采用平板菌落计数法［12］，结合各菌种的形态学特征［13-14］，观察霉菌菌种混合孢子液样品在Ⅰ号改良培养基、马铃薯葡萄糖琼脂和孟加拉红琼脂3种培养基上的生长情况，进行霉菌数量及菌相研究。

1.2.3 烟草及烟草制品中霉菌数量检验

烟草及烟草制品采样时应避免微生物污染，采样后应尽快检验，否则应将样品保存于低温干燥处。样品处理分别为：①烟草样品：在无菌环境条件下，将样品剪成小块，充分混合；②烟草制品（卷烟）样品：去除卷烟滤嘴。称取25 g样品，置于含有225 mL无菌蒸馏水的均质袋中，封口后置于拍击式均质器中处理3 min；每处理30 s，将均质袋换反方向继续处理；均质速度档位：2，均质力度：标准；用无菌吸管从均质袋一侧将滤液取出。此液即为1∶10的稀释液。采用平板菌落计数法［12］进行烟草及烟草制品的霉菌数量检验，方法同1.2.2节。

2 结果与讨论

表1 8种试验霉菌在5种常用霉菌培养基上的生长情况①

2.1 烟草及烟草制品中霉菌数量检验用培养基的初筛结果

2.1.18 种试验霉菌在5种常用霉菌培养基上的生长情况

通过观察8种试验霉菌在5种常用霉菌培养基上的生长情况（表1）发现：局限曲霉不能在马铃薯葡萄糖琼脂、孟加拉红琼脂和察氏琼脂培养基上生长；匍枝根霉在察氏琼脂和含20%蔗糖的高渗察氏琼脂培养基上生长极弱；匍枝根霉和总状毛霉在高盐察氏琼脂培养基上呈弱生长状态。若检验样品被匍枝根霉污染，由于该霉菌在上述培养基上生长较弱（在一定时间内仅形成很小的菌落），易被生长快的霉菌形成的菌落所掩盖，因而会造成菌落漏检的现象。由此可见，上述5种培养基不宜用于烟草及烟草制品中霉菌数量检验。

2.1.28 种试验霉菌在4种改良培养基上的生长情况

依据上述研究，大多培养基虽能满足烟草及烟草制品中一般霉菌的生理需求，但不能满足某些嗜干性霉菌的生长需求；含20%蔗糖的高渗察氏琼脂培养基虽能满足烟草及烟草制品中某些嗜干性霉菌及大多数普通霉菌的生长，但对于匍枝根霉而言，由于不能利用该培养基中的NaNO3作为自身生长的N源营养物，因而生长较弱。对此，本研究根据烟草及烟草制品中常见污染霉菌的营养需求及生理特点，选用营养成分和渗透压能满足一般霉菌生长需求的马铃薯葡萄糖琼脂培养基作为基础培养基，并对其进行了改良，通过加入一定量的NaCl适当提高培养基的渗透压，以达到既不影响烟草及烟草制品中普通霉菌生长，又能满足嗜干性霉菌生长所需渗透压的目的。8种试验霉菌在Ⅰ～Ⅳ号改良培养基上生长情况的观察结果（表2）表明，8种试验霉菌在4种改良琼脂培养基上均能生长，在Ⅰ号培养基上各菌种生长最佳，因此选择Ⅰ号改良培养基进行下一步研究。菌落。2.2烟草及烟草制品中霉菌数量检验用培养基的复筛结果

表2 8种试验霉菌在Ⅰ～Ⅳ号4种改良培养基上生长情况

通常，霉变的烟草及烟草制品中存在多种霉菌，由于不同霉菌种类间存在拮抗作用，且生长速度也差异较大，生长快的霉菌形成的菌落可掩盖生长慢的霉菌

通过预试验，选择烟草及烟草制品中常见的3种霉菌（总状毛霉、产黄青霉和局限曲霉）并制成菌种混合孢子液，采用平板菌落计数法（结合各菌种的形态学特征）对初筛结果中效果较好的Ⅰ号改良培养基进行霉菌菌种混合孢子液样品中霉菌数量及菌相的研究，进一步考察Ⅰ号改良培养基的适用性，并选择目前研究中广泛选用的马铃薯葡萄糖琼脂、孟加拉红琼脂培养基作为参照，结果见表3和图1。

由表3和图1可知，马铃薯葡萄糖琼脂和孟加拉红琼脂培养基中仅观察到总状毛霉和产黄青霉2种试验霉菌生长，霉菌数量为3.5×104～4.2×104cfu/mL；而在Ⅰ号改良培养基中3种试验霉菌均能生长，且霉菌数量高达6.0×104cfu/mL。这说明Ⅰ号改良培养基不仅适合一般霉菌的生长，也适合嗜干性霉菌局限曲霉的生长，是一种适用于烟草及烟草制品中霉菌数量检验用的培养基。

2.3 实际样品的检验结果

表3 3种霉菌混合孢子液在3种霉菌培养基中的霉菌数量及菌相检验结果①

图1 局限曲霉、产黄青霉和总状毛霉菌种混合孢子液在3种培养基中的生长情况

为检验Ⅰ号改良培养基在烟草及烟草制品实际样品霉菌数量检测中的应用效果，选用6种烟草及烟草制品进行实验研究，结果如表4所示。由表4可知：①对于香料烟样品A和B，Ⅰ号改良培养基中霉菌数量的检验结果均高于孟加拉红琼脂和马铃薯葡萄糖琼脂培养基。其中，表观正常的香料烟A样品在Ⅰ号改良培养基中的霉菌数量分别比孟加拉红琼脂和马铃薯葡萄糖琼脂培养基中提高了38.5%和20.0%，而人工霉变的香料烟B样品分别提高了69.4%和74.3%。②烤烟A（自然霉变）和烤烟B（表观正常）样品在3种培养基中的霉菌数量检验结果相近。③“红双喜（12 mg）”和“中南海（8 mg）”卷烟在3种培养基中的霉菌数量检验结果均小于10 cfu/g。

表4 霉变或正常烟草及烟草制品在3种霉菌培养基中霉菌数量的检验结果①（cfu/g）

由表4还可以看出，同一样品在不同培养基中的霉菌数量存在一定差异，其主要原因可能与样品中污染霉菌种类有关。霉变烟草及烟草制品中常见污染既有黄曲霉、黑曲霉、产黄青霉、桔青霉、总状毛霉、匍枝根霉等一般霉菌，也有局限曲霉、阿姆斯特丹曲霉等嗜干性霉菌，因而当霉变样品中有嗜干性霉菌污染时，Ⅰ号改良培养基显示出不仅适合嗜干性霉菌生长，亦适合一般霉菌生长的优势。反之，当样品中不存在嗜干性霉菌时，Ⅰ号改良培养基呈现出与其他2种培养基相同的检验效果。综上所述，Ⅰ号改良培养基适合用于烟草及烟草制品中霉菌数量的检验。

3 结论

研发了既能满足一般霉菌的生长，也能满足部分嗜干性霉菌生长的改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基。本培养基是一种适用于烟草及烟草制品中霉菌数量检验的理想培养基，具有检验霉菌菌相全面、霉菌数量结果准确等优点，以此为基础建立的霉菌数量检测方法，能够满足烟草及烟草制品中霉菌检测的需求。

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Development and Application of Medium for Tobacco Mold Counting Test

LIN Huaqing，ZENG Lingjie，WANG Jiale，SHA Yunfei，QI Dawei，and WU Da*
Shanghai Tobacco Group Co.，Ltd.，Shanghai 200082，China

In order to develop a medium suitable for testing the amount of mold，eight molds common in tobacco and tobacco products were chosen(including Aspergillus flavus，A.niger ATCC16404，A.restrictus CGMCC 3.3973，Penicillium citrinum，P.chrysogenum，Mucor racemosus CGMCC 3.206，Rhizopus stolonifer CGMCC 3.2045 and Trichoderma viride)，five common mold media(Rose Bengal agar，Czapek agar，High salt Czapek agar，hypertonic Czapek agar containing 20%sucrose，and Potato dextrose agar)and four pilot media were tested via primary and secondary screening.The results showed that comparing with other media，the improved medium，potato dextrose agar No.1(potato 200 g，glucose 20.0 g，NaCl 30.0 g，agar 16.0 g，chloramphenicol 0.1 g and distilled water 1000 mL)，was more suitable for tobacco mold counting test due to its coverage of microflora and accurate counting results.

Tobacco；Tobacco product；Mold counting；Medium

TS414

A

1002-0861（2014）11-0029-04

国家烟草专卖局标准项目“烟草及烟草制品霉变的判定”（2013QB020）。

林华清（1984—），女，硕士，工程师，主要从事烟草化学及质量安全研究工作。E-mail：linhq@sh.tobacco.com.cn；*

吴达E-mail：wud@sh.tobacco.com.cn

2014-05-30

责任编辑：洪广峰E-mail：hgf@ztri.com.cn

电话：0371-67672660