组织因子和基质金属蛋白酶－2在肝细胞癌侵袭转移中作用

施育华，孙锦卫，王学斌，丁会民

（盐城市第三人民医院普通外科，江苏224001）

组织因子和基质金属蛋白酶－2在肝细胞癌侵袭转移中作用

施育华*，孙锦卫，王学斌，丁会民

（盐城市第三人民医院普通外科，江苏224001）

目的：研究肝细胞肝癌组织中的组织因子（TF）及基质金属蛋白酶－2(MMP-2)表达，对肝癌侵袭转移的作用及两者之间的关系。方法：用免疫组织化学EnVisionTM法检测肝癌56例及其癌旁肝组织标本中TF和MMP-2的表达。结果：（1）肝癌组织中TF及MMP-2的阳性表达均明显高于癌旁组织（P<0.05）；（2）癌静脉浸润、肝内外转移、无或包膜不完整组织中TF和MMP-2的表达显著高于相应对照组（P<0.05）；（3）肝癌中TF表达和MMP-2表达呈正相关。结论：HCC中TF及MMP-2表达明显增高，且与癌侵袭转移有关。

肝细胞肝癌；组织因子；基质金属蛋白酶-2；免疫组织化学法

近年来发现组织因子（tissue factor,TF）除参与凝血外,还可促进多种肿瘤微血管的生成，促进肿瘤的复发与转移。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是一组蛋白水解酶，能有选择的降解细胞外基质中多种成分，分泌生长因子、细胞因子。还能激活潜在的细胞因子、生长因子以及趋化因子，清除细胞表面蛋白，在肿瘤细胞的浸润、转移、血管生成等多方面起重要作用。近来研究表明MMP-2在乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌和胆管癌等多种恶性肿瘤中表达明显增多，且与肿瘤的浸润程度和预后密切相关[1]。选取我院2010年8月—2013年8月肝癌切除手术术后病理确诊56例，采取免疫组织化学法检测人肝细胞肝癌 (hepatocellular carcinoma，HCC)中TF及MMP-2的表达,研究其对HCC侵袭转移的影响及两者之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 肝癌56例中男45例，女11例,年龄41～72岁，平均64.65岁。肿瘤直径<5cm 41例，肿瘤≥5cm 15例，有完整包膜的32例,无包膜或包膜不完整者24例;肝内转移10例。血清HBsAg阳性45例,阴性11例，甲胎蛋白 (AFP)<20ng/mL 14例,≥20ng/mL 42例。所有患者术前均未行如放化疗、肝动脉栓塞及免疫治疗等特殊治疗。

1.2 方法 （1）免疫组化染色法：兔抗人TF免疫组化单克隆抗体（浓缩型）、鼠抗人MMP-2单克隆抗体、EnvisionTMplus试剂盒（福建迈新生物技术开发公司）。制备4μm连续切片，经二甲苯溶液脱蜡,梯度乙醇水化,高温高压抗原修复,TF抗体和MMP-2抗体的工作浓度均为1∶100。应用EnVisionTM免疫

组化染色法，参照试剂说明书进行操作。DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，封片。磷酸盐缓冲液(PBS)分别代替TF和MMP-2单克隆抗体为阴性对照。（2）分析方法：TF及MMP-2均以细胞膜和（或）细胞质现棕黄色颗粒为阳性细胞，在400倍镜下随机选取5个区域计数。据阳性细胞所占比例判断：染色阳性细胞比例≤10%为阴性；阳性细胞＞10%为阳性。所有切片均由我院外科及病理科经验丰富的医师采用双盲法阅读。

1.3 统计学处理 用SPSS19统计软件处理数据，组间差异性比较采用χ2检验，并进行TF和MMP-2 Spearman相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 组织因子（TF）表达 TF呈棕黄色染色，主要位于细胞质，癌旁肝组织TF阳性4例（7.14%），HCC中TF阳性32例（57.14%)。HCC中TF阳性率明显高于癌旁肝组织，差异有统计学意义(P<0.05)。组间比较结果显示，TF表达在静脉浸润、肿瘤有无包膜及肝内外转移的HCC组织中TF阳性率较对照组明显增高(P<0.05)。但与患者的年龄、性别、HBsAg,肿瘤大小,肝硬化因素均无相关性（P>0.05），见表1。

2.2 基质金属蛋白酶（MMP-2）表达 HCC组织中MMP-2的阳性表达32例（62.5%）。MMP-2的阳性表达主要位于癌细胞胞质中或胞膜上，呈棕黄色，癌旁肝组织MMP-2阳性10例（17.86%）。HCC中MMP-2阳性率明显高于癌旁肝组织，差异有统计学意义(P<0.05)。组间比较显示，在静脉浸润、无包膜、肝内外转移组中明显增高，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。而MMP-2表达与患者年龄、性别、HBsAg、肿瘤大小、肝硬化未见相关性（P>0.05），见表1。

表1 TF、MMP－2的表达与肝细胞肝癌临床病理的关系

2.3 HCC中TF表达与MMP-2表达关系 HCC组织中TF表达阳性32例中MMP-2阳性29例, MMP-2阴性3例，TF表达阴性24例中MMP-2阳性6例，MMP-2阴性18例,经Spearman相关分析表明，HCC组织中TF与MMP-2的表达呈正相关关系（r＝0.671，P＜0.01），提示TF和MMP-2可能协同促进肝癌的侵袭和转移。

3 讨 论

组织因子（TF）是分子量为47kD的跨膜糖蛋白,

为机体生理性凝血的主要启动因子，能激发外源性凝血途径，最终生成凝血酶和纤维蛋白，从而发挥止血作用。近来研究表明TF在多种恶性肿瘤中高表达，且参与肿瘤新生血管生成，促进肿瘤的生长、浸润和转移[2-3]。随着TF研究深入，肿瘤的靶向治疗前景乐观。TF的研究在乳腺癌、肺癌、肠癌、前列腺癌、卵巢癌及食管癌等肿瘤中已开展，且显示TF在肿瘤中的高表达，而TF在HCC中的研究尚少。本组结果示，HCC中TF阳性率为57.14%，而癌旁肝组织TF阳性率为7.14%，表明肝癌组织中TF表达增高。进一步研究发现静脉浸润、无包膜、肝内外转移的HCC患者中TF阳性率明显增高，结果与施育华等[4-5]报道一致。肿瘤侵袭转移是影响预后的关键，肿瘤细胞的生长、浸润和转移很大程度上取决于肿瘤新生血管的生成。研究表明组织因子可通过多种途径作用于瘤内血管生成,但主要是促进VEGF的合成。即当组织因子与FVIIa结合后,可激活TF胞内端酪氨酸激酶,引起第二信使Ca2+内流,通过MAPK或PKC途径的信号传导引起VEGF转录增加[6]。

基质金属蛋白酶（MMPs）家族因其需要Ca2+、Zn2+等金属离子作为辅助因子而得名，其家族成员具有相似的结构。MMPs几乎能降解细胞外基质（ECM）中的各种蛋白成分,从而破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障。在肿瘤侵袭转移中起关键性作用，因此MMPs在肿瘤浸润转移中的作用受到越来越多的重视，但具体的作用机制尚不明确。研究较多的是MMP-9和MMP-2[7-8]。Zhang等[9]研究发现，肝癌细胞中MMP-2表达增加，且显著高于正常肝细胞及癌旁组织，提示其可作为侵袭和转移的指标。本实验利用免疫组化方法对HCC中MMP-2的表达进行研究，结果显示HCC中MMP2表达明显高于癌旁组织。且其表达在静脉浸润、无包膜、肝内外转移中增加，提示MMP-2与肿瘤的侵袭转移有关。可能由于MMP-2被激活后可形成Ⅳ型胶原酶降解和破坏靠近肿瘤表面的细胞外基质，使肿瘤细胞向周围组织侵润，最终导致肿瘤局部侵袭和远处转移[10]。

本研究还发现HCC中TF的表达和MMP-2的表达具有正相关性，提示在肿瘤侵袭转移中，TF及MMP-2可能有协同作用。研究表明TF在肿瘤细胞中，可以作用于MMP-2[11]降解血管局部细胞外基质和基底膜后，促进内皮细胞芽生、增殖和迁移直至管腔形成。同时肿瘤细胞表面的TF可与配体FVIIa结合后，启动外源性凝血途径，使得肿瘤患者体内高凝状态的形成。促凝血活性的肿瘤细胞转移播散后，包裹在血小板纤维蛋白的聚合物中，可躲避机体免疫系统的监视，在靶器官中形成转移灶。

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[5]施育华,王学斌,丁会民.组织因子在肝癌血管生成中作用的实验研究［J］.中国普通外科杂志,2010,19(1):93-95.

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[9]Zhang R,Pan X,Huang Z,et al.Osteopontin enhances the expression and activity of MMP-2 via the SDF-1/CXCR4 axis in hepatocellular carcinoma cell lines［J］.PLoS One,2011, 6(8):e23831.

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[11]Ott L,Fisher EG,Miyagi Y,et al.A role for tissue factor in cell adhension and migration mediated by interaction with actin-binding protein 280［J］.J Cell Biol,1998,140(5): 1241-1253.

Effects of tissue factors and matrix metalloproteinase-2 in invasion capability of hepatocellular carcinoma

SHI Yuhua,SUN Jinwei,DING Huimin
(Department of General Surgery,Third Hospital of Yancheng,Jiangsu 224001)

Objective:To study the expression of tissue factor（TF）and matrix metalloproteinase-2(MMP-2)in hepatocellular carcinoma(HCC)and explore the effects of TF and MMP-2 on cell invasion and metastasis of HCC.Methods:The expression of TF and MMP-2 in 56 specimens of HCC and adjacent normal liver tissues were detected by EnVisionTM immunohistochemistry.Results:The expression levels of TF and MMP-2 were obviously higher in HCC tissues than that in tumor-adjacent normal tissues(P<0.05);MMP-2 and TF expression was correlated to vein invasion,intrahepatic metastasis, and the tumor without envelope(P<0.05)．It had coherence abaout the expression of TF and MMP-2(P<0.01).Conclusion:The expression of TF and MMP-2 HCC may be related to the in invasion and metastasis of HCC.

hepatocellular carcinoma;tissue factor;matrix metalloproteinase-2;immunohistochemistry

R735.7

A

施育华，男，汉族，江苏盐城人，生于1972年6月，本科，主任医师。研究方向：肿瘤外科。

2014-06-15

1006-2440（2014）04-0331-03