改良型生物硅胶膜对大鼠神经干细胞增殖与分化的影响

杨晓青，陈旭义，程世翔，刘英富，刘春蓉，李瑞欣，李 娜，李建国

(1天津中医药大学，天津300193;2武警后勤学院附属医院;3武警后勤学院; 4军事医学科学院卫生装备研究所;5北京中日友好医院)

神经干细胞(Neural stem cells，NSCs)是一类具有自我更新能力和多种分化潜能的细胞，体外诱导分化的成体干细胞可用于中枢神经损伤疾病及退行性神经系统疾病的治疗。找到体外培养NSCs的方法并诱导其分化为特定的神经细胞，进而达到神经修复和细胞治疗的目的乃当今神经科学界的研究热点之一。目前，体外培养及诱导NSCs向神经元方向分化的方法很多，力学因素对NSCs增殖与分化的影响也颇受关注［1，2］，良好的细胞生长载体是NSCs力学生物学机理研究的基础。本研究采用改良型生物硅胶膜作为培养载体，观察了NSCs的增殖、生长、分化及转归情况，旨在为进一步观察力学因素对NSCs增殖、诱导分化的影响提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物为孕16 d的SD胎鼠，由军事医学科学院实验动物中心提供。实验仪器:SA-300V型全自动高压灭菌仪(美国赛默飞公司)，自动超纯水仪(美国赛默飞公司)，普通倒置显微镜及照相装置(中国奥林巴斯公司)，二氧化碳细胞培养箱(美国赛默飞公司)，倒置荧光显微镜及照相装置(德国Leica公司)。实验试剂:荧光标记二抗(Sigma公司)，神经巢蛋白(Nestin)、神经元烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体(Pharmingen公司)，明胶、青链霉素、胰岛素、转铁蛋白和葡萄糖(国产)，含有F12的DMEM培养基及胎牛血清(FBS均购自Gibco公司。改良型生物硅胶膜厚度为0.25mm，面积为3 cm×3 cm，以环形胶圈固定于培养器底部;普通培养皿为一次性塑料培养皿，经射线消毒灭菌。

1.2 NSCs的分离及分组培养 取上述SD大鼠，乙醚麻醉后置于75%乙醇中浸泡，无菌条件下取出胚胎。D-Hanks液冲洗2次，取胎鼠大脑皮质，置入含有10%FBS的DMEM/F12培养基中，机械研磨、吹打，200目滤网过滤制成单细胞悬液。调整细胞密度为1×106/mL，并随机分为观察组和对照组，分别接种于铺被明胶的改良型生物硅胶膜及普通培养皿中，置37℃、5%CO2培养箱中培养;48 h后全量换为无血清DMEM/F12培养基，并加入胰岛素、转铁蛋白、葡萄糖继续培养，隔天再次全量换液。

1.3 NSCs的鉴定 在原代培养48 h后对培养细胞进行Nestin免疫荧光染色鉴定，7 d后对NSCs贴壁分化的细胞进行NSE和GFAP免疫荧光染色鉴定。具体步骤:PBS缓冲液清洗3次，95%乙醇固定30 min，PBS缓冲液清洗3次，加入0.5%的Triton X-100，静置20 min，再用缓冲液洗3次，BSA封闭20 min，分别加入相应的Nestin、NSE和GFAP一抗，37℃下反应1 h、4℃过夜，缓冲液洗3次，加入相应的荧光二抗，37℃下反应1 h，用缓冲液洗3次，甘油封片。在相差倒置显微镜下进行与Nestin、NSE和GFAP相应的荧光激发，观察细胞形态学变化并拍照，在荧光显微镜下进行阳性细胞计数(200倍镜下选取10个视野，取均数)。阳性细胞率=阳性细胞数/4，6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)标记核×100%。

1.4 NSCs增殖活性检测 培养后第1、2、3、4、5、6、7天，分别取两组细胞以胰酶消化，调整细胞密度为1× 105/mL。两组各取200μL细胞悬液置于24孔培养板，每孔加入5 g/L的四甲基偶氮唑蓝(MTT)20μL，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中继续培养4 h，离心、收集孔内细胞，每孔加入150μL的DMSO振荡10 min，酶标仪490 nm波长下自动检测吸光度值，绘制生长曲线。每组实验均重复3次。

1.5 统计学方法 采用SPSS13.0统计学软件进行数据处理。计量资料以±s表示，组间比较采用方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCs形态学变化 用含10%FBS的培养基培养24 h后，两组均见细胞贴壁生长，并形成数十至数百个细胞组成的神经细胞球;48 h后，细胞增殖形成数百到数千个细胞组成的神经细胞球，神经球边缘细胞出现突起并逐渐延伸至临近的神经细胞球，其后细胞逐渐分化，并呈多种形态:具有一个或两个长突起，胞体呈圆形或椭圆性的神经元样细胞;具有多个突起的星形胶质样细胞;具有多个细突起且不断分支的少突胶质细胞样细胞。与对照组相比，观察组连接神经球的突起较多，且较规律(图1-a，b，c)。电镜下可见细胞聚集而成的神经球，边缘有单个神经细胞向外爬出，并伸出突起与临近细胞相连(图2-a，b)。

图2 电镜下原代培养的NSCs

2.2 NSCs鉴定情况 培养48 h后，两组神经细胞球的 NSCs特异标志物Nestin均呈阳性(红色荧光)。贴壁生长7 d后，NSE阳性细胞的胞质及突起呈绿色，观察组和对照组阳性细胞率分别为25.14% ±1.98%、24.67%±2.05%(P＞0.05);GFAP阳性细胞呈绿色荧光，观察组和对照组阳性细胞率分别为59.48%±2.07%、60.87%±1.08%(P＞0.05)。

2.3 NSCs增殖情况 两组NSCs增殖情况无显著差异(P＞0.05)，生长曲线见图3。

图3 细胞生长曲线

3 讨论

干细胞是个体发育过程中产生的具有多向分化潜能和自我更新能力的一类细胞。目前，利用NSCs分化而成的神经元及神经胶质细胞治疗脊髓损伤、脑部损伤及肿瘤等术后导致的神经损伤已成为国内外研究的热点［1，2］，其机制可能为神经元和胶质细胞可分泌多种营养因子、改善微环境，从而使轴突再生，使神经纤维形成髓鞘［3～5］。NSCs的诱导分化受多种因素的影响［6］，其中力学因素可影响细胞结构、功能并使其骨架重排［7，8］，亦可对胚胎NSCs产生生物力学效应、促进其发育及分化［9］。

改良型生物硅胶膜是由有机硅化合物制作的生物膜，可作为细胞生长的良好载体。本研究选取孕16 d胎鼠的大脑皮质作为细胞来源，建立胚胎NSCs的体外培养体系［10～13］，观察组细胞接种于改良型生物硅胶膜上、对照组细胞接种于普通培养皿中。结果显示，培养第2天，显微镜下两组均可见神经细胞球生成，贴壁良好，细胞球边缘有突起并呈辐射状向外发出，神经细胞球NSCs特异标志物Nestin均呈阳性;培养第7天，贴壁分化的NSE、GFAP阳性细胞率分别为25%、60%左右，组间比较无显著差异。提示两组培养的细胞均可分化为神经元细胞及神经胶质细胞;改良型生物硅胶膜并不影响NSCs的正常分化。此外，通过MTT法检测细胞活力所得生长曲线显示，NSCs在改良型生物硅胶膜上的生长及增殖过程与普通培养皿中细胞较一致。提示改良型生物硅胶膜对NSCs的生长具有较好的生物相容性。值得注意的是，改良型生物硅胶膜贴壁情况较普通培养基差，仍需进一步研究并寻找一种更为优良的贴壁方法。

综上所述，改良型生物硅胶膜对NSCs的生长、增殖及诱导分化无明显影响，但能促进细胞之间突起的增长，可作为培养载体用于研究力学因素对NSCs增殖、诱导分化的影响。

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