白叶单枞黑茶抗氧化及体外降血糖活性研究

叶琼仙，刘 静，苗爱清，王冬梅，*

（1.中山大学药学院，广东广州510006；2.广东省农业科学院茶叶研究所，广东英德513000）

“白叶单枞”茶是广东省特色茶品种资源，也叫岭头单枞茶，属于乔木型大叶类，含有丰富的茶多酚[1]，在广东省种植面积近万顷。白叶单枞茶可加工为乌龙茶、红茶、黑茶等，其加工的黑茶陈香浓郁略带药香，滋味浓厚，品质风格独特，与云南普洱茶品质相当[2]。白叶单枞黑茶的加工过程是其品质形成的关键，其中“渥堆”是加工过程中的特殊工艺，实质是以微生物的活动为中心，通过胞外酶、微生物自身物质的协同作用，使茶叶内含物发生极为复杂的变化，形成黑茶特殊的品质风味[3]。

黑茶具有显著的抗氧化、降血糖血脂的保健作用，张冬英等[4]利用高通量筛选法寻找普洱茶具有降血糖血脂作用的活性成分，发现普洱茶醇提物对PPARδ受体有激活作用，有潜在的降血糖血脂作用。近期研究[5]表明，普洱茶水提物可降低四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的血糖水平，与降血糖阳性药阿卡波糖的活性没有统计学差异；同时具有显著的α-葡萄糖苷酶抑制活性。大量研究表明[6-7]，糖尿病病人机体中自由基产生与清除能力是不平衡的，处于氧化应激的状态，而持续产生的自由基和抗氧化防御系统缺陷可能介导糖尿病及其并发症的发病与恶化进程。由于黑茶中抗氧化活性、降血糖活性的物质基础尚不明晰，本文利用DPPH法、FRAP法及α-胰淀粉酶、α-葡萄糖苷酶抑制活性分别评价黑茶的抗氧化活性及体外降血糖活性，并对活性最强的部位进行HPLC-DAD-MS成分分析，以期为阐明黑茶降血糖活性的物质基础、并为将黑茶开发成具有降血糖功效的保健食品或药物提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白叶单枞黑茶样品 广东省农业科学院茶叶研究所制备；α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，EC 3.2.1.2）、4-硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）日本和光纯药工业株式会社；TPTZ（2，4，6-tripyridy-s-triazine，2，4，6-三吡啶-三吖嗪）、DPPH·（1，1-dipheny1-2-picrylhydrazyl，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）、α-胰淀粉酶（porcine pancreaticα-amylase，EC 3.2.1.1）、芦丁（Rutin） 美国Sigma公司；阿卡波糖（Acarbose） 拜耳医药保健公司；HPLC分析用乙腈 为色谱纯溶剂，美国TEDIA；其他试剂 均为市售分析纯。

TSQ Quantum液相色谱质谱联用仪（HPLC系统包括P4000四元泵、UV 6000LP二极管阵列检测器（DAD）、电喷雾电离（ESI）离子源） 美国Thermo Quest Finnigan公司；TU-1901双光束紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；AG285万分之一电子天平 瑞士METTLER TOLEDO公司。

1.2 实验方法

1.2.1 白叶单枞黑茶的提取与不同极性溶剂萃取 黑茶样品1kg，加入8倍量（W/V）的60%乙醇溶液超声提取1h，过滤，将滤液减压浓缩至小体积（约1.0L），得黑茶60%乙醇提取物（以下简称黑茶醇提物），后依次用氯仿、乙酸乙酯及正丁醇进行萃取，萃取液挥干溶剂后得氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及水层留余物，各干燥萃取物重量分别为：22.31、1.78、3.26、33.32g。

1.2.2 总黄酮含量测定 参考文献方法[8]并作适当调整，精密称取105℃下干燥恒重的芦丁对照品适量，用50%的乙醇溶解，定容，配制为0.1g/L的芦丁标准品溶液，备用。分别精密吸取上述芦丁标准液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0m L于25m L的比色管中，加入8m L 1.5%A lCl3和4m L醋酸-醋酸钠的缓冲液（pH 5.5），并用50%乙醇水溶液定容至刻度，摇匀，静置30min后于415nm波长处测定吸光度值，以显色液中芦丁的质量（mg）为横坐标，吸光度值为纵坐标，用最小二乘法进行线性回归，得回归方程y=1.1169x-0.0134，相关系数R2为0.9995。以上述操作方法测定2.0m L样品溶液于415nm波长下吸光度值，并将吸光度值代入上述回归方程中计算黑茶提取物及各萃取物中总黄酮含量，以芦丁当量（mg RE/g）来表示。

1.2.3 总酚含量测定 参考文献方法[9]，以没食子酸为标准品绘制标准曲线，得回归方程y=0.042x-0.0475，相关系数R2为0.9999，测定黑茶多酚聚合物的总酚含量。2.0m L一定浓度的样品溶液与1.0m L Folin-Ciocalteau显色剂混合，充分振荡后静置3～4m in，再加入1.0m L 10%Na2CO3溶液，摇匀后于室温下避光显色30m in，测定780nm波长处的吸光度值，并计算样品中总酚的含量。每个样品重复测定3次，并以没食子酸当量（mg GAE/g）计算黑茶样品的总酚含量。

1.2.4 DPPH·清除活性测定 参考文献方法[10]并做适当调整，精密称取黑茶各样品0.01000g，用95%乙醇配制成1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625mg/m L 5种浓度的样品溶液，备用。精密量取2.0m L 95%乙醇，加入2.0m L 200μmol/m L DPPH·溶液（溶于95%乙醇），再加入1.0m L样品溶液，充分混合，避光反应30m in后在517nm处测定其吸光度As。各待测物对DPPH·的清除率P可用下式计算：

式中，As为2.0m L 95%乙醇+2.0m L DPPH·溶液+1.0m L样品溶液的吸光度；Ar为4.0m L 95%乙醇+1.0m L样品溶液的吸光度；A0为3.0m L 95%乙醇+2.0m L DPPH溶液的吸光度。平行操作6次，并通过浓度曲线计算各样品的EC50。

1.2.5 FRAP（铁离子还原）法 参照Benzie等[11]的方法。精密称取TPTZ适量，溶解于40mmol/L HCl溶液，配制浓度为10mmol/L的TPTZ溶液，备用。精密称取FeCl3·6H2O适量，蒸馏水溶解并配制浓度为20mmol/L的FeCl3溶液，备用。将300mmol/L pH 3.6乙酸盐缓冲溶液、10mmol/L TPTZ溶液与20mmol/L FeCl3溶液以体积比10∶1∶1充分混合配制为FRAP试剂，现配现用。

取2.0m L 0.2mg/m L样品溶液加入3.0m L FRAP试剂，混合后在37℃下反应10min后，测定593nm处吸光度的增加值。以FeSO4溶液为对照绘制标准曲线，得回归方程y=0.006x+0.0641，相关系数R2为0.9998。计算0.2mg/m L浓度下样品的抗氧化活性（FRAP值），以达到相同吸光度值所需的FeSO4毫摩尔数表示，以及当量浓度（EC1）相当于1.0mmol/L FeSO4还原能力的样品浓度。

1.2.6 黑茶提取物及各萃取物对α-胰淀粉酶抑制活性 采用3，5-二硝基水杨酸法[12]测定黑茶各样品对α-胰淀粉酶的抑制活性。取200μL 5mg/m L的样品溶液（0.2mg样品溶于NaCl浓度为6mmol/L的20mmol/L pH 6.9的磷酸钠缓冲液）与200μLα-淀粉酶溶液（1.0U/m L，溶于pH 6.9的磷酸钠缓冲液）混合，在37℃下孵育10m in后加入400μL 0.25%的淀粉溶液，置于37℃水浴中反应10m in后加入1.0m L DNS显色剂（1% 3，5-二硝基水杨酸、12%酒石酸钾钠共同溶于0.4mol/L NaOH）终止反应，沸水浴10min后冷却至室温，加入10m L蒸馏水稀释后于540nm波长处测定吸光度值（A样品）。以缓冲液代替酶溶液，保持其他条件不变测背景吸收（A背景）；含NaCl的缓冲液代替样品溶液，不改变其他条件作为阴性对照（A阴性）。用以下公式计算样品对α-淀粉酶的抑制率：

1.2.7 黑茶提取物及各萃取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性 参考已报道方法[13]，在96孔板中，20μL的样品溶液（用20%甲醇水溶液配制为50μg/m L）与40μL 5mmol/L的PNPG（4-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷）溶液（溶于pH 7.0的磷酸钠缓冲溶液）在37℃下孵育5m in后，加入10μL 1.0U/m Lα-葡萄糖苷酶溶液（溶于pH7.0的磷酸钠缓冲溶液），振荡均匀，37℃下反应10m in后加入140μL 0.2mmol/L的Na2CO3溶液终止反应，于400nm波长处测定吸光度值（A样品），并以缓冲溶液代替酶溶液，保持其他条件不变测背景吸收（A背景）；以20%甲醇水溶液代替样品溶液，不改变其他条件作为空白对照（A空白）。每个样品平行6次，用以下公式计算样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率：

1.2.8 HPLC-DAD-MS分析 准确称取黑茶样品适量，用色谱甲醇-水溶液超声溶解配制成浓度为3mg/m L的样品溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤后得供试品溶液，备用。

液相色谱分析条件：Ultimate AQ C18（4.6mm×250mm i.d.，5μm，Welch），流动相乙腈（A）-0.1%甲酸（B），0～15m in，5%～20%A；15～35min，20%A；35～40m in，20%～30%A；40～45m in，30～32%A；45～50m in，32%～90%A；50～60m in，90%A。进样量：10μL；流速：1000μL，分流比：8∶2。DAD扫描波长范围：190～600nm。

质谱分析参数：ESI离子源，正负离子同时检测；离子化电压：4kV；喷雾电压4kV；鞘气压力：23arb；辅助气压力：25arb；毛细管温度：276℃，Source CID：28。m/z扫描范围：100～1500amu。

2 结果与讨论

2.1 黑茶醇提物及各萃取物的总黄酮及总酚含量

经HPLC分析得知，氯仿萃取物中主要含有茶叶生物碱类成分（数据未给出），其他成分含量较低；因此通过氯仿萃取可脱去黑茶醇提物中大部分生物碱成分，再依次由乙酸乙酯、正丁醇萃取，可使黄酮类、酚类物质得以富集，故乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及萃取后水层留余物的总黄酮含量及总酚含量均较黑茶醇提物高，其中乙酸乙酯萃取物的含量最高，总黄酮含量达（155.68±4.34）mg RE/g，总酚含量达（313.84±9.79）mg GAE/g；而正丁醇萃取物次之，总黄酮和总酚含量分别为（86.01±2.51）mg RE/g，（205.33± 5.94）mg GAE/g。

表1 黑茶提取物及各萃取部位的总黄酮、总酚含量Table1 Total flavonoids and total phenols contentof dark tea extracts

2.2 黑茶醇提物及各萃取物的DPPH·清除活性及还原能力

DPPH法是一种筛选自由基清除剂的简便方法，在国内外有着广泛的应用[14]。从表2可知，在50μg/m L浓度下，黑茶乙酸乙酯萃取物及正丁醇萃取物的DPPH·清除率可达70%以上，较黑茶醇提物高；EC50的结果表明，除氯仿萃取物外，各萃取物的清除活性较黑茶醇提物有所增强，但增强的程度不一，其中乙酸乙酯萃取物及正丁醇萃取物清除活性最强，EC50分别为13.72μg/m L和18.89μg/m L。

铁离子还原法（FRAP法）是利用Fe3+能与三吡啶三吖嗪（TPTZ）形成复合物，在体系中Fe3+被抗氧化剂或待测样品还原成Fe2+，使其形成的复合物呈明显的蓝色，在593nm处具有特征吸收这一原理来评价待测样品的抗氧化活性[15]。FRAP法不是针对某一种自由基的清除活性，而是反映样品总的还原能力，适合实验室用于评价天然产物的抗氧化活性[16]。结果（表2）显示，除氯仿萃取物外，其他萃取物的还原能力较黑茶醇提物均有不同程度的提高，其中乙酸乙酯萃取物还原能力最强，FRAP值（50μg/m L）为1119.50μg/m L，EC1为43.38μg/m L。

综合DPPH法及FRAP法的评价结果可知，白叶单枞黑茶的乙酸乙酯萃取物的DPPH·清除活性、还原能力最强，乙酸乙酯萃取有利于富集黑茶中抗氧化活性成分。

2.3 黑茶提取物及各萃取物α-胰淀粉酶及α-葡萄糖苷酶的抑制活性

表2 黑茶提取物及各萃取物的DPPH·清除活性及还原能力Table2 The results of DPPH·scavenging activity assay and FRAP assay of dark tea extract

图1 黑茶提取物及各萃取物对α-胰淀粉酶（n=3）及α-葡萄糖苷酶（n=6）抑制活性Fig.1 α-pancreatic amylase andα-glucosidase inhibitory activity of dark tea extracts

通过抑制α-胰淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性，可抑制食物中的淀粉（多糖）分解，减少单糖的吸收，从而降低餐后血糖浓度。黑茶醇提物和各萃取物对α-胰淀粉酶及α-葡萄糖苷酶的抑制活性测定结果如图1所示，在5mg/m L浓度下，各萃取物均显示较黑茶醇提物更强的α-胰淀粉酶抑制活性，其中乙酸乙酯萃取物的抑制活性最强，为95.83%；在50μg/m L下，除氯仿萃取物外，其他萃取物及黑茶醇提物α-葡萄糖苷酶的抑制率均达80%以上，其中乙酸乙酯萃取物的抑制率为91.30%。

综合抗氧化活性及体外降血糖活性评价结果可知，黑茶醇提物及各萃取物中，含有丰富黄酮类及多酚类成分的乙酸乙酯萃取物为强抗氧化剂同时具有最强的α-胰淀粉酶及α-葡萄糖苷酶抑制活性。人体血液中的高血糖可通过产生过量的活性氧自由基，增加氧化应激来破坏体内的氧化平衡，从而损伤细胞[17]。据报道[18]，具有抗氧化活性的物质可有助于β细胞（分泌胰岛素）的再生，且能保护胰脏细胞对抗链脲霉素的细胞毒性。乙酸乙酯萃取物富集了黑茶中的抗氧化物质，进一步表明黑茶乙酸乙酯萃取物具有潜在的降血糖作用，可为黑茶的深入开发与研究提供科学依据。

2.4 黑茶乙酸乙酯萃取物化学成分的分析

图2 黑茶乙酸乙酯萃取物的HPLC-MS-UV色谱图Fig.2 Chromatography of HPLC-MS-UV analysis of ethyl acetate extractof dark tea

表3 黑茶乙酸乙酯萃取物的化合物保留时间、紫外吸收特征与质谱特征Table3 Retention time and characteristics of UV absorption wavelength andmass spectrum of components in ethyl acetate extractof dark tea

根据黑茶乙酸乙酯萃取物色谱图（图2）中各色谱峰的紫外吸收特征，MS、MS2数据，结合参考文献[19]，推定出的化合物列于表3（化合物11、12、14结构尚未确定）。经HPLC-DAD-MS分析，推定出乙酸乙酯萃取物中的12个化合物，其中包含有3种主要的茶叶生物碱，其他的主要为以芹菜素、山奈酚为苷元的黄酮糖苷类成分，仍含有少量的黄酮苷元成分。

3 结论

白叶单枞黑茶60%醇提物经溶剂萃取得到氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及水层留余物，其中乙酸乙酯萃取物具有最高总黄酮含量及总酚含量，为155.68mg RE/g和313.84mg GAE/g。同时，乙酸乙酯萃取物具有强的抗氧化活性和体外降血糖活性，DPPH·清除活性的EC50为13.72μg/m L，FRAP铁离子还原能力EC1为43.38μg/m L；5mg/m L浓度下对α-胰淀粉酶抑制率为95.83%，50μg/m L浓度下对α-葡萄糖苷酶抑制率为91.30%。经HPLC-DAD-MS分析，推定出乙酸乙酯萃取物中的12个化合物，其中包含有3种主要的茶叶生物碱，其他的主要为以芹菜素、山奈酚为苷元的黄酮糖苷类成分，仍含有少量的游离黄酮类成分。白叶单枞黑茶中具有强抗氧化活性的物质同时也具有强的α-胰淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性，具有开发成为降血糖药物或保健食品的潜力。

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