苦瓜皂苷提取物微胶囊化缓释性能及体外对糖苷酶活性影响研究

靳晓明，尤玲玲，冯 超，葛怀娜，刘金福，*

（1.天津农学院动物科学与动物医学学院，天津300384；2.天津农学院食品科学与生物工程学院，天津300384；3.天津市农副产品深加工技术工程中心，天津300384）

近年来，糖尿病严重威胁着人类的健康，据估计，世界上大约3.4亿人口正在不同程度的遭受糖尿病的困扰，而且预计到2030年这个数据将翻近一倍。最新统计，我国糖尿病患者已高达1.1亿人，防治糖尿病已刻不容缓。对于糖尿病患者，尤其是Ⅱ型病人，餐后高血糖是发展为糖尿病的先期预兆，持续性餐后高血糖甚至可引起血管损害、功能和代谢障碍，产生多种并发症[1]。α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制剂作为新型的口服降血糖药物，广泛的应用于Ⅱ型糖尿病的治疗，可有效降低餐后高血糖。目前，市场上的α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物，如阿卡波糖等合成产品，虽疗效好，但价格较高且有副作用。因此，植物中高效低毒价廉的天然α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制剂就备受人们青睐。研究发现苦瓜中分离得到的皂苷粗提物对α-葡萄糖苷酶具有较强的抑制作用[2-4]，可为人们提供一种天然的、安全有效的酶抑制剂类降糖活性物质。

常见的苦瓜提取物制备的保健食品，一般是以片剂、胶囊、冲剂等形式供人们食用，活性物质在胃肠中短时间内集中地被消化、分解、代谢，功效作用的时间较短。本文采用锐孔凝固浴法，以海藻酸钠和壳聚糖为壁材，对苦瓜皂苷提取物进行包埋，制成微胶囊，并使其具有缓释效果，以期保护活性成分，延长在胃肠中作用时间和对分解碳水化合物的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性进行更有效的抑制，同时，缓解酶抑制剂带来的副作用，用于保健食品开发，更好的发挥其降低餐后血糖的功效。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苦瓜 购于天津市王顶堤红旗农贸市场；对硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（PNPG） 上海嘉适科学仪器有限公司；阿卡波糖片（拜糖平） 北京拜耳医药保健有限公司；α-葡萄糖苷酶 上海沪峰生物科技有限公司；α-淀粉酶 北京索莱宝科技有限公司；3，5-二硝基水杨酸（DNS） 天津市光复精细化工研究所；壳聚糖 威海紫光科技园有限公司；其余试剂 均为国产分析纯。

FD-1C型冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；RE-50型旋转蒸发器 上海申生科技有限公司；752型可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；METTLER TOLEDO型pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；TY-80R型摇床 江苏省金坛市医疗仪器厂；JB-3型定时恒温磁力搅拌器 上海雷磁仪器厂新泾分厂；TQZ-312型台式全温振荡器 上海精宏实验设备有限公司；LGR20-W型离心机 北京京立离心机有限公司；Bio-Tek ELX800型全自动酶标仪 美国宝特公司。

1.2 实验方法

1.2.1 苦瓜皂苷提取物制备 将新鲜苦瓜洗净去瓤、切片烘干、粉碎过80目筛。称取100g苦瓜果实干粉，加60%的乙醇1500m L，在70℃反复提取三次，每次2h。提取液过滤后浓缩至无醇味，得苦瓜皂苷粗提液，将粗提液真空冷冻干燥成粉状备用[5]，测定其中皂苷含量[6]。

1.2.2 微胶囊的制作 称取适量苦瓜皂苷提取物干粉和一定量的海藻酸钠溶于50m L蒸馏水中，搅拌均匀，45℃水浴中加热；以100m L的1%的乙酸溶液溶解一定量的壳聚糖和氯化钙，充分搅拌，NaOH调节pH至5.5。用5m L的注射器吸取苦瓜提取物干粉海藻酸钠溶液，缓慢滴入在摇床上振荡的壳聚糖-氯化钙溶液中，静置15m in，流水洗去微球表面的苦瓜粗提物干粉，收集微球，60℃干燥12h，得直径小于1mm的微胶囊。

1.2.3 微胶囊载药量和包埋率测定 精确称取微胶囊0.2g，研细，充分溶于3m L甲醇中，4000r/m in离心5min，取上清液，于468nm的波长下测定总皂苷含量。按下式计算载药（总皂苷）量和包埋（总皂苷）率。

式中：C为所测样品中固形物的质量浓度；W为微球质量；G为0.2g微球中原始添加芯材质量；DL为微球载药量的质量分数；ER为微球包埋率[7]。

1.2.4 体外释放实验 将2g已干燥的微胶囊样品加入100m L模拟胃液（pH1.2的盐酸溶液）中，37℃恒温振荡2h，然后将样品转入100m L的模拟肠液（pH=7.5的磷酸盐缓冲溶液）中作用10h。并在指定时间1、2、4、6、8、10、12h分别取1m L的样液，同时补充等量的等温介质。所取样液4000r/min离心5min，取上清液测定其中皂苷含量，用相同质量的空白微胶囊作对照，方法同上。由下式求得各时间点的苦瓜提取物皂苷的累积释放率Q。

式中：Cn为第n个时间点所取样品中固形物的质量浓度；V为释放介质总体积；Vi为第i个时间点的取样体积；Ci为第i个时间点所取样品质量浓度；W为微球总质量；DL为微球载药量的质量分数。

1.2.5 模拟胃肠环境对α-葡萄糖苷酶活性的影响对α-葡萄糖苷酶抑制的测定在Jutta Eichler等[8]的基础上稍做修改，采用九十六孔板法，用微量移液器向每孔中准确加入样液50μL，pH 6.8缓冲液50μL，0.2U/m L α-葡萄糖苷酶液50μL，室温孵育20m in后，加入50μL 1.5mg/m L对硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（PNPG），37℃孵育30m in，2500r/m in离心3m in，取100μL上清液，405nm测定吸光度值。蒸馏水替代样液和缓冲液替代酶液作为空白组，蒸馏水替代样液作为控制组。样液为将2g已干燥的微胶囊，0.75g苦瓜提取物干粉及药物拜糖平，分别加入100m L模拟胃液中，37℃，50r/min，恒温振荡2.5h，在0、0.5、1、1.5、2、2.5h分别取1m L的样液，同时补充等量的等温介质。所取样液4000r/m in离心5m in，取上清液作为样液测定对α-葡萄糖苷酶的抑制，由于苦瓜皂苷本身有颜色，所以每个样品测定背景吸收，对结果进行校正，按下式计算抑制率。微胶囊放入模拟肠液，方法同上，选取0、2、4、6、8、10h时间点取样。

1.2.6 模拟胃肠环境对α-淀粉酶活性的影响 对α-淀粉酶抑制的测定在Zhang等[9]的基础上稍做修改，取0.5m L样液加入0.5m L 0.5mg/m Lα-淀粉酶液，25℃温育10m in，再加入0.5m L 0.5%的淀粉溶液，准确反应5m in后，加入1m L 3，5-二硝基水杨酸（DNS），90℃水浴10min，冷却到室温，蒸馏水定容至25m L，540nm测定吸光度值。蒸馏水替代样液作为空白对照。样液的获得同1.2.5所述。

1.3 数据处理

实验数据用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，数据以±s表示。

2 结果与分析

2.1 苦瓜皂苷提取物微胶囊的体外缓释效果

在前期研究所得的最优条件（海藻酸钠浓度5%、壳聚糖浓度0.5%、氯化钙浓度3.5%、海藻酸钠与芯材的质量比0.6∶1）下制备微胶囊，将其在模拟胃液和肠液中进行体外释放实验，以释放时间为横坐标，累积释放率为纵坐标绘图，结果见图1。

图1 微胶囊中苦瓜皂苷体外释放曲线Fig.1 Release profiles ofMomordica charantia saponins microcapsule in vitro

由图1可知，微胶囊中苦瓜皂苷在模拟胃液中1h释放率达到31.19%，2h累积达到52.14%，说明在酸性条件下，微胶囊的壁材壳聚糖和海藻酸钠形成的包膜，易遭到破坏，导致芯材释放。当从胃液移入肠液后，苦瓜皂苷释放缓慢，10h达到81.20%，可见，所制备的微胶囊在模拟的胃液和肠液中具有良好的缓释性能，这一结果与参考文献一致[10]。分析原因是由于海藻酸钠/壳聚糖微胶囊具有一定的耐酸性和肠溶性，可以对包埋物进行控制释放[11]，其可能的机制是海藻酸钠与氯化钙发生反应生成圆形海藻酸钙骨架，同时将药物包裹其中；另外，海藻酸钠还可与壳聚糖的醋酸盐形成聚离子复合物填塞骨架网眼，使药物释放受到阻碍[12]。这样苦瓜提取物微胶囊在模拟胃肠环境中缓慢溶胀并溶蚀，皂苷类等物质通过溶解扩散及微胶囊的溶蚀而释放。

2.2 模拟胃肠环境对α-葡萄糖苷酶抑制作用

实验中按照微胶囊的包埋率计算，微胶囊中药物全部释放后苦瓜提取物干粉浓度约为7.1mg/m L，对照组苦瓜皂苷提取物干粉在胃肠环境中的初始浓度为7.5mg/m L。分别在模拟胃肠环境中微胶囊及对照组对α-葡萄糖苷酶活性的影响如图2、图3所示。

由图2、图3可知，苦瓜皂苷提取物微胶囊在模拟胃肠环境中对α-葡萄糖苷酶有明显的抑制作用，而且随着皂苷释放量的增加，抑制率呈上升趋势，在模拟胃环境中微胶囊释放皂苷1h，抑制率为61.57%，2h可达到80%以上；在模拟肠环境中2h，抑制率为51.35%，4h达到68.92%，8h后仍然具有抑制作用，累计抑制率为80.24%。与之相反，未包埋的苦瓜皂苷提取物和拜糖平药物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用随时间推移在模拟胃肠环境中有逐渐下降的趋势，胃中2h后抑制率分别下降了27.07%和28.34%，肠中6h后抑制率分别下降了6.77%和2.37%。从α-葡萄糖苷酶抑制剂的作用机理看，它是通过与小肠粘膜刷状缘的α-葡萄糖苷酶的中心活性部位结合，竞争性抑制其相对活性，使葡萄糖的吸收减缓，吸收时间后延，从而降低餐后高血糖[13-14]，其发挥作用的场所主要在肠道中。从图2、图3中可以得出，苦瓜皂苷提取物通过微胶囊化包埋后，对有效成分起到了一定的保护作用，最大限度的减少了苦瓜皂苷活性成分在胃液中的破坏，从而使更多的活性成分进入到肠道中发挥效力。临床上，服用拜糖平后，大量碳水化合物在小肠内吸收受阻，进入大肠后碳水化合物酵解增加，产气增多，常会引起肠鸣，腹胀，恶心，呕吐，食欲减退，甚至导致胃肠痉挛性疼痛、顽固性便秘等不良反应。图3显示，随着时间的推移，在肠环境中微胶囊由于具有缓释效果而不断释放皂苷等物质，持续的抑制α-葡萄糖苷酶的活性。通过包埋可以有效的缓解大量药物进入肠道后集中释放可能带来的副作用。

图2 模拟胃环境对α-葡萄糖苷酶活性的影响Fig.2 Alpha glycosidase enzyme activity effect in mimic gastric environment

图3 模拟肠环境对α-葡萄糖苷酶活性的影响Fig.3 Alpha glycosidase enzyme activity effect in mimic intestinal environment

2.3 模拟胃肠环境对α-淀粉酶抑制作用

在模拟胃肠环境中微胶囊及对照组对α-淀粉酶活性的影响如图4、图5所示。

由图4、图5可知，微胶囊对α-淀粉酶有一定的抑制作用，而且随着在胃肠中的皂苷释放量的增加，抑制率均有上升趋势，且都是刚开始抑制率增长速率较快，随着时间的推移，抑制率增长速率减慢，相反的，未包埋的苦瓜皂苷提取物和药物拜糖平对α-淀粉酶的抑制作用随时间推移都有所降低。在模拟胃环境中微胶囊释放皂苷0.5h，抑制率为28.67%，2h后达到40%以上；在模拟肠环境中微胶囊释放皂苷2h，抑制率为18.69%，8h后累计抑制率为24.52%。α-淀粉酶是通过与酶形成酶抑制剂复合物，使酶失活，从而延缓或阻碍了碳水化合物在肠道内的消化和吸收，减少糖分的摄取，降低血糖和血脂水平，从而有效的防止餐后高血糖的发生[15-16]。同样的，从图4、图5我们可以看出，通过对苦瓜皂苷提取物进行包埋，随着时间的推移，对α-淀粉酶抑制率不断提高，起到了对功效成分的保护作用，同时可以控制释放，延长了天然产物活性成分的作用时间，可减少食用次数，提高其利用率，并减少副作用。

图4 模拟胃环境对α-淀粉酶活性影响Fig.4 Alpha amylase activity effect in mimic gastric environment

图5 模拟肠环境对α-淀粉酶活性影响Fig.5 Alpha amylase activity effect in mimic intestinal environment

3 结论

本实验以壳聚糖，海藻酸钠为壁材，对苦瓜提取物进行了包埋，在前期研究得出最佳的制备工艺条件下制得的苦瓜提取物微胶囊，在模拟胃液中2h，苦瓜提取物皂苷累积释放率为52.14%，再在肠液中释放10h，累积释放率达81.2%，表明微胶囊缓释性能良好。而且微胶囊在胃肠中缓慢释放，均显示对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶有一定的抑制作用，抑制率随着释放量的增加有上升趋势，相比较未包埋的苦瓜提取物和拜糖平，微胶囊化起到了保护活性成分、延长作用时间、提高药物利用率和缓解副作用等效果。该研究为开发具有辅助降血糖功效的功能食品提供了参考。

[1]张丽.滇丁香、茜草抑制α-葡萄糖苷酶活性成分研究[D].开封：河南大学，2010.

[2]田力东，张名位，郭祀远，等.不同苦瓜品种的皂苷含量及对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的比较[J].中国农业科学，2008，41（10）：3415-3421.

[3]Matsuur H，Asakawa C，Kurimoto M，etal.Alpha-glucosidase inhibitor from the seeds of balsam pear（Momordica charantia）and the fruit bodies of Grifola frondosa[J].Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2002，66（7）：1576-1578.

[4]王琪，邓媛元，张名位，等.苦瓜皂苷和多糖的连续提取工艺及其对α-葡萄糖苷酶的抑制作用[J].中国农业科学，2011，44（19）：4058-4065.

[5]张卫军.苦瓜皂甙的分离纯化及其指纹图谱的建立[D].哈尔滨：东北农业大学，2008.

[6]张玉婵，刘金福，张平平，等.苦瓜茎、叶中皂苷类物质的提取及分离纯化[J].食品研究与开发，2010，31（4）：53-56.

[7]孟庆廷，陈万东.壳聚糖-海藻酸钠叶绿素亚铁微胶囊的制备及缓释性能研究[J].食品科学，2010，31（20）：137-140.

[8]Jutta Eichler，Adam W.Lucka，Clemencia Pinilla.Novelαglucosidase inhibitors identified using multiple cyclic peptide combinatorial libraries[J].Molecular Diversity，1996，1：233-240.

[9]Lei Zhang，Shelly Hogan，Jianrong Li，etal.Grape skin extract inhibits mammalian intestinal a-glucosidase activity and suppresses postprandialglycemic response in streptozocin-treated mice[J].Food Chemistry，2010，126（2）：466-471.

[10]李沙，侯新朴.海藻酸钠-壳聚糖微囊成型机理及其对大分子药物的载药、释药研究[J].药学学报，2003，38（5）：380-383.

[11]何荣军，杨爽，孙培龙，等.海藻酸钠/壳聚糖微胶囊的制备及其应用研究进展[J].食品与机械，2010，26（2）：166-168.

[12]卢凤琦，曹宇顺，赵焰，等.壳聚糖-海藻酸钠盐微囊对药物的缓释作用[J].中国医药工业杂志，1996，27（6）：247-249.

[13]曾岚.甘草中α-葡萄糖苷酶抑制物质的提取、纯化和结构研究[D].广州：华南理工大学，2012.

[14]郑晓媛.虎杖提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究[D].成都：四川大学，2007.

[15]黄绍华，胡晓波，王震宙.山药多糖对淀粉酶活力的抑制作用[J].食品工业科技，2006，27（9）：94-95.

[16]刘自琴，黄惠华.绿茶和红茶浸提液对α-淀粉酶的抑制作用研究[J].现代食品科技，2010，26（7）：680-681.