罗曼鹤鸡骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定

李双星，朴丰源，戚 媛，刘晓辉，李亚晨，刘 爽，李双月

(1哈尔滨医科大学附属第一医院，哈尔滨150001;2大连医科大学)

骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一类来源于中胚层、具有多向分化潜能的成体干细胞，可向骨、神经、肝、心肌、内皮等多种胚层细胞分化，已经成为组织工程和细胞移植的重要细胞来源，在组织功能/结构重建、创伤修复及人工器官等领域具有广阔的应用前景［1，2］。有关BMSCs的研究目前多集中于人、大鼠和小鼠，鸡BMSCs相关的研究报道不多见。鸡作为首个进行基因组测序的禽类，已揭示了众多胚胎发育机制，动物肿瘤可由病毒引起亦是以鸡为模型首次证明，鸡是胚胎发育、肿瘤和免疫系统等研究的重要模型，鸡BMSCs已成为相关研究不可替代的体外模型［3～5］。2009年，Mahesh等首次分离培养出鸡BM-SCs，但其采用的密度梯度离心法操作繁琐，同时亦破坏了BMSCs的生长微环境，限制了BMSCs的培养和应用［6，7］。2012年11月～2013年5月，我们利用全骨髓贴壁法对鸡BMSCs进行分离培养和鉴定，以期建立一种简单、高效的鸡BMSCs分离、培养体系，为鸡BMSCs的进一步研究和应用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料 罗曼鹤鸡，1～14天龄，由大连韩伟集团提供。DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(Hyclone公司)，二苯基四氮唑溴盐(MTT)、青霉素、链霉素(上海生工生物工程有限公司)，地塞米松、β-磷酸甘油、抗坏血酸、谷氨酰胺、胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤、吲哚美辛(Sigma公司)，FITC-CD29抗体、PE-CD34抗体(e-Bioscience公司)。

1.2 鸡BMSCs的分离培养 鸡脱臼处死，无菌分离完整的股骨及胫骨，清除附着的肌肉组织，暴露骨髓腔并反复冲洗，尤其是干骺端。将冲出的骨髓细胞过筛网制成单细胞悬液，离心后用含10%FBS的DMEM培养液重悬并接种于培养皿，于37℃、CO2饱和湿度培养箱中培养。接种24 h后全量换液，以后每3 d换液1次。待细胞达到80%～90%融合，0.25%胰酶消化并按1∶2进行传代，利用差速贴壁特性逐步纯化BMSCs。

1.3 鸡BMSCs的鉴定

1.3.1 形态学观察 倒置显微镜下观察细胞形态及贴壁状况，并记录。

1.3.2 增殖能力检测 取生长状态良好的第3代BMSCs，以4×103/mL接种于96孔板，每组6复孔，每3 d换液1次，采用MTT法检测其生长增殖能力。从培养第1天到第7天，每天相应复孔加入20μL MTT(5 g/L)溶液，37℃孵育4 h，小心弃去上清液，每孔加入150μL DMSO，微量振荡器震荡10 min，使结晶物充分溶解，酶标仪检测490 nm波长处各孔光密度值(OD值)，以时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制生长曲线。

1.3.3 表面标志物检测 第3代BMSCs胰蛋白酶室温消化，离心收集细胞，PBS清洗细胞并制成单细胞悬液。各样本分别加入抗CD29和CD34的荧光标记抗体，同时设立同型阴性对照，4℃避光孵育，用流式细胞仪进行检测。

1.4 鸡BMSCs分化能力检测

1.4.1 鸡BMSCs成骨诱导分化 将2×108/L生长状况良好的第3代BMSCs接种于培养板，待细胞长至80%～90%融合时，在各诱导孔加入成骨诱导培养基(DMEM培养液含10%胎牛血清、5μg/mL抗坏血酸、10 mmol/Lβ-磷酸甘油、100 nmol/L地塞米松)，对照孔加入含10%胎牛血清的DMEM常规完全培养液，每3天换液1次。诱导分化第21天进行茜素红染色。

1.4.2 鸡BMSCs成脂诱导分化 选用第3代生长状态良好的 BMSCs，2×108/L接种，待细胞长至80%～90%融合时，在各诱导孔加入成脂诱导培养基(DMEM培养液含10%胎牛血清、5μg/mL胰岛素、1μmol/L地塞米松、10 mmol/L异丁基甲基黄嘌呤、600 nmol/L吲哚美辛)，对照孔加入DMEM常规完全培养液，每3天换液1次。诱导分化第14天进行油红O染色。

2 结果

2.1 鸡BMSCs形态学变化 鸡骨髓细胞初始接种时悬浮于培养液中，24 h后部分细胞贴壁，呈短梭形、多角形等形态;6 d后部分细胞形成散在集落，细胞突起变长、变大，并且长短不一、粗细不均(图1A);14 d左右细胞集落相互靠近并融合成片(图1B)。传代后细胞生长速度明显变快，细胞形态趋向均一，长梭形、束状或漩涡状排列(图1C)。

图1 鸡BMSCs的形态学变化

2.2 鸡BMSCs生长曲线 见图2。由图2可见，鸡BMSCs的生长潜伏期为1～3 d，之后进入对数生长期，第6天以后开始进入平台期。

图2 第3代鸡BMSCs生长曲线

2.3 鸡BMSCs表面标志物 流式检测结果显示，BMSCs的表面标志物 CD29的阳性表达率为92.10%，造血系细胞的表面标志CD34表达率仅为0.80%(图3)，提示第3代贴壁细胞主要是BMSCs。

2.4 鸡BMSCs成骨诱导分化情况 成骨诱导第7天可见部分细胞聚集成团、呈放射状排列，10 d左右出现细胞聚集形成的结节，之后结节逐渐增多，部分细胞轮廓不清、透光性差。鸡BMSCs诱导分化进行第21天茜素红染色，阳性区域呈现鲜红色，有明显的矿化结节形成，见图4。对照孔内未见着色区域。

图3 鸡BMSCs表面标志物表达情况

图4 鸡BMSCs来源的成骨细胞茜素红染色(×200)

2.5 鸡BMSCs成脂诱导分化情况 BMSCs成脂诱导14 d后，细胞密度减低，细胞间空隙增大，可见圆形高亮细胞，有些椭圆形细胞内可见呈串珠样排列分布的脂样小滴，脂滴变大并合并呈串珠状。油红O染色显示胞质内有大量鲜红色串珠样或大的融合脂滴，细胞体积较大呈圆形(图5)。对照细胞染色无脂质沉积。

图5 鸡BMSCs来源的成脂细胞油红O染色(×100)

3 讨论

鸡胚是发育生物学、肿瘤学、血管药理学等研究的理想模型，成年鸡更是迟发性神经毒性等研究不可替代的动物模型。而有关BMSCs的研究目前多集中于人和啮齿类动物，家禽中多集中于猪，鸡BMSCs的相关报道较少。本研究利用差速贴壁法，从罗曼鹤鸡的骨髓中分离培养出高纯度、高分化潜能的BMSCs。

目前，BMSCs体外分离培养体系主要包括密度梯度离心法、流式细胞仪分选法、免疫磁珠法、全骨髓贴壁法。密度梯度离心法可根据细胞密度的不同提取出单核细胞进行培养，但操作较繁琐、细胞获得量较低。流式细胞术和免疫磁珠法虽可获得纯度较高的BMSCs，但对细胞活性有较大损伤，且价格昂贵，难以普及［8］。差速贴壁培养法是根据BMSCs的贴壁特性，通过定期换液去除骨髓中的不贴壁细胞的分离方法。此种方法筛选出的BMSCs活性高，损伤小，而且骨髓中的其他干细胞和基质细胞能分泌生长因子和细胞外基质，模拟体内微环境，促进BMSCs贴壁生长，BMSCs能较快适应体外培养环境，细胞增殖迅速［9］。要获得较大数量、活性较高的BMSCs，全骨髓贴壁法更为可取。

各种属来源的BMSCs目前均缺乏特异性的检测指标，通常根据细胞形态、细胞增殖特点、相对特异的表面标记和多向分化潜能等方面相结合来对其进行鉴定，鸡BMSCs亦是如此。本实验罗曼鹤鸡骨髓中分离的单个核细胞，通过差速贴壁筛选能够生长形成长梭形或成纤维细胞样、呈束装或旋涡状排列的细胞克隆，与间充质干细胞的形态学特征一致［10］。细胞生长曲线是判断细胞活性的重要指标。细胞传代后，一般先是短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的潜伏期，即进入大量分裂的对数生长期。在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平顶期，然后退化衰亡。本研究用MTT法检测并绘制了第3代鸡BMSCs的生长曲线，经过3～6 d的对数生长期后进入平台期。田少囡等［11］报道，北京油鸡肺间充质干细胞在最佳培养体系内对数生长期可持续约4 d，品系及组织来源可能会影响间充质干细胞的细胞活性。高健等［12］报道，家禽中猪BMSCs的细胞活性也受品系影响，进一步证实了本实验结果。

BMSCs目前缺乏特异性的表面标记物，一般认为CD29、CD90、CD105等都可作为BMSCs的重要标记物，而CD34、CD45等为造血系细胞的表面标志物，在BMSCs上不表达［13～16］。本实验参考相关文献报道，选择CD29和CD34作为甄别BMSCs的标记物。结果证明，本研究得到了纯度较高的BMSCs。

判定BMSCs的另一个重要指标是看其是否具有多向分化能力。分离的鸡BMSCs向成骨细胞分化21 d后，细胞出现明显的钙化结节，茜素红染色阳性，显示细胞分化为成骨细胞并有分泌钙质的功能。鸡BMSCs向脂肪细胞分化14 d后，细胞油红O染色阳性，细胞内出现明显的脂质小滴，证明细胞已向成脂细胞分化。

总之，本实验成功分离培养出罗曼鹤鸡BMSCs并进行了相关鉴定，建立了适合鸡BMSCs的体外培养和鉴定体系，为进一步深入研究提供了实验基础。

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