HPLC法测定甘肃地产不同品种酿酒葡萄中的花色苷

李琪，李广*，金丽琼，罗清楠

（甘肃省分析测试中心，甘肃兰州730000）

HPLC法测定甘肃地产不同品种酿酒葡萄中的花色苷

李琪，李广*，金丽琼，罗清楠

（甘肃省分析测试中心，甘肃兰州730000）

利用高效液相色谱(HPLC)法对甘肃地产9种酿酒葡萄中的花色苷进行了检测分析。在9种酿酒葡萄中共定性检测到9种花色苷（黑比诺除外，共检测到5种）。利用相对百分含量对这9种花色苷进行了比较分析，结果发现，9种酿酒葡萄都以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷含量最高，其他花色苷含量依酿酒葡萄品种不同而各异；利用9种花色苷总峰面积对9种酿酒葡萄所含花色苷总量进行了比较分析，其含量顺序依次为美乐＞宝石＞晚红蜜＞蛇龙珠＞西拉＞赤霞珠＞品丽珠＞黑比诺＞马瑟兰；同时，利用4种花色苷对照品所得标准曲线方程对9种酿酒葡萄中的4种花色苷含量进行了定量计算。为甘肃产区酿酒葡萄在花色苷方面的品质评价提供了重要参考依据。

酿酒葡萄；花色苷；高效液相色谱

花色苷是葡萄与葡萄酒中一类重要的多酚类物质，具有抗癌、抗氧化、防止动脉硬化等功能，是葡萄与葡萄酒中最主要的呈色物质，而颜色恰是评价葡萄酒质量好坏的重要依据之一[1-3]。花色苷可与其他物质（如单宁）化合，进而影响葡萄酒的口感，对葡萄酒的品质有着重要的影响[4]。葡萄酒中的花色苷主要来源于酿酒葡萄的果皮[5-6]。因此，酿酒葡萄的品质直接关乎着葡萄酒的质量。葡萄中花色苷的种类和含量因葡萄品种、种植地、气候及种植条件的不同而各异[7-8]。所以，花色苷的种类及含量对葡萄及葡萄酒的品质具有重要的意义。

河西走廊是甘肃种植酿酒葡萄的唯一产区，而河西走廊地处北纬36°～40°之间，年1 500h以上的有效积温适合酿造葡萄生长需要；干燥的气候又可有效抑制葡萄病虫害发生；作为灌溉用水的祁连山雪水和地下井水富含矿物质；土层深厚，透气性良好，具有种植优质酿酒葡萄的最佳光、热、水、土等组合资源，赋予地产酿造葡萄自然天成的高品质，因而甘肃也是我国葡萄酒的主要产区。其中莫高、祁连、国风、紫轩等品牌地产葡萄酒更是享誉国内外[9-10]。本研究以甘肃地产酿酒葡萄为对象，对甘肃目前大面积种植的9种酿造葡萄中的主要花色苷采用HPLC法进行了检测分析，为进一步确定甘肃不同品种葡萄酒的品质提供了重要依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

9种葡萄样品均采自甘肃河西走廊不同酿酒葡萄种植园。

花翠素3-O-葡萄糖苷、花青素3-O-葡萄糖苷、甲基花青素3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素3-O-葡萄糖苷对照品：诺维信（中国）生物技术有限公司；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）：德国默克公司；磷酸（优级纯）：天津市科密欧化学试剂开发中心；甲酸（分析纯）：广东光华科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

Waters 1525高效液相色谱仪（配二极管阵列检测器（2998 PDA）和在线脱气机）：美国Waters公司；AE200电子天平：瑞士梅特勒-托利多国际股份有限公司；0.22μm有机相过滤器：上海密粒膜分离技术有限公司；ELGA MK2超纯水器：北京格瑞恩科技发展有限公司；KQ-50B超声波清洗器：江苏省昆山市超声仪器有限公司；JHX280H涡旋振荡器：北京京辉凯业科技有限公司；H-2050R高速离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

ZorbaxSB-C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流速1mL/min；柱温35℃；进样量20μL；检测波长535nm；流动相：水/乙腈/甲酸（A=80/10/7；B=40/50/7），梯度洗脱见表1。

表1 梯度洗脱条件和程序Table 1 Gradient elution condition and program

1.3.2 葡萄中花色苷的提取

挑选着色均匀的葡萄，剥出果皮均质后，准确称取样品2.5g于50mL聚乙烯管中，加入浸提液（甲醇∶水=1∶1，磷酸调pH=2.0）20mL，冰浴中超声波辅助提取10min，再涡旋振荡提取10min，重复提取2次，最后以10 000r/min冷冻离心5min，取上层清液过0.22μm滤膜后上液相色谱仪分析。

1.3.3 葡萄中花色素苷的定性和定量分析

因目前市场上花色苷的对照品较少且昂贵，本研究花色苷采用标样花翠素3-O-葡萄糖苷、花青素3-O-葡萄糖苷、甲基花青素3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素3-O-葡萄糖苷部分定性，然后参考相关文献[11-18]定性其他花色苷。定量分析方面，花翠素3-O-葡萄糖苷、花青素3-O-葡萄糖苷、甲基花青素3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素3-O-葡萄糖苷根据各自对照品所得标准曲线方程计算其含量，其他花色苷的含量表示为9种花色苷峰面积的相对百分含量。

2 结果与讨论

2.1 处理方法的选择

参考相关文献[19-21]，分别对以下3种常用的处理方法进行了比较：

a.选取15粒着色均匀的葡萄，剥出果皮称质量，加入30mL甲醇超声辅助提取（温度≤35℃），每提取一次换一次水，以防止温度过高。每次提取20min，共提取6次，每3次提取液定容至100mL，合并提取液，4℃存放。重复2次，过0.22μm滤膜后上液相色谱仪分析。

b.挑选着色均匀的葡萄，剥出果皮均质后，准确称取样品2.5g于50mL聚乙烯管中，加入浸提液（甲醇/水=1∶1，磷酸调pH=2.0）20mL，冰浴中超声波辅助提取10min，再涡旋振荡提取5min，重复提取2次，最后以10 000r/min冷冻离心5min，取上层清液过0.22μm滤膜后上液相色谱仪分析。

c.挑选70～100粒着色均匀的葡萄，解冻剥皮，液氮快速处理，冷冻干燥24h，冻干粉末装于自封袋中。称取0.5g葡萄粉末，加10mL 2%甲酸-甲醇溶液，放于离心管中，超声10min，然后摇床振荡30min，8 000r/min离心5min，转上清液于100mL圆底烧瓶中，重复4次（套黑袋）并在旋转蒸发仪上蒸干（28℃），用上样缓冲液定容至10mL，过0.22μm滤膜后上液相色谱仪分析。

通过以上不同处理方法的对比发现，3种处理方法所得结果基本一致，但方法a和c操作起来比较繁琐，而b则较为简便且省时省力，因此，最后选定方法b为花色苷最佳处理方法。

2.2 花色苷标准曲线的绘制

分别精确称取花翠素3-O-葡萄糖苷、花青素3-O-葡萄糖苷、甲基花青素3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素3-O-葡萄糖苷标准适量，用0.01%的盐酸-甲醇溶液配制成质量浓度为5μg/mL、10μg/mL、30μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的标准混合溶液，经0.22μm滤膜过滤后，在确定的色谱条件下进样测定，分别对4种花色苷的质量浓度（x）和峰面积（y）进行拟合，得到标准曲线方程，结果见表2。由表2可知，4种花色苷质量浓度为5.0～100μg/mL，标准曲线方程的相关系数均在0.999 5以上，线性关系良好。

表24 种花色苷的回归方程、相关系数Table 2 Regression equation and correlation coefficient of four anthocyanins

2.3 不同品种酿酒葡萄中的花色苷组分

根据高效液相色谱分析，9种酿酒葡萄中花色素苷的色谱图及4种标样色谱图分别见图1、图2。其中，色谱图1、图2中1、2、4、5号峰即标样花翠素3-O-葡萄糖苷、花青素3-O-葡萄糖苷、甲基花青素3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素3-O-葡萄糖苷的出峰时间与文献[6-9]报道相同，根据这4个峰的出峰时间再参考文献[11-18]推断出其他色谱峰代表的成分。

图1 9种酿酒葡萄中花色苷的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of anthocyanins in nine wine grapes

图2 4种花色苷对照品HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of four anthocyanin reference substance

2.3.1 9种不同品种酿酒葡萄中花色苷的相对含量

表3为9种酿酒葡萄皮中花色苷的相对含量。由表3可知，在9种酿酒葡萄中相对含量最高的均是二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷。其中，赤霞珠中⑤相对含量为36.97%，其次是⑨、⑦、①，其他均在10%以下，依次为③、④、②、⑥、⑧、②；宝石中⑤相对含量为44.89%，其次是⑨、①、⑦，10%以下的依次为③、④、②、⑧、⑥；晚红蜜中⑤相对含量为37.49%，其次是①、③，10%以下的依次为⑦、⑨、④、②、⑧、⑥。从表3结果分析可知，9种花色苷在不同酿酒葡萄中的含量顺序各不相同。通过比较可发现，9种花色苷在葡萄中的含量顺序中赤霞珠和美乐、蛇龙珠和晚红蜜除⑥⑧顺序颠倒外，其他顺序基本一致；其他葡萄中花色苷的含量顺序则各异，但均以⑤相对含量最高，相对含量均在30%以上。；美乐中⑤相对含量为48.47%，其次是⑨、⑦，10%以下的依次为①、③、④、②、⑧、⑥；黑比诺中只检测到5种花色苷，⑤相对含量为47.11%，其次是①、④、③，10%以下的为②；蛇龙珠中⑤相对含量为40.14%，其次是①、③、⑦、⑨，10%以下的依次为④、②、⑥、⑧；品丽珠中⑤相对含量为40.04%，其次是⑦、①，10%以下的依次为⑨、③、④、⑥、②、⑧；西拉中⑤相对含量为32.14%，其次是⑨、⑦，10%以下的依次为④、③、①、⑧、⑥、②；马瑟兰中⑤相对含量为34.46%，其次是⑦、④，10%以下的依次为⑨、①、③、⑥、

表3 酿酒葡萄皮中花色苷的相对百分含量Table 3 Relative percentage of anthocyanins in different wine grapes %

2.3.2 9种酿酒葡萄中花色苷含量的比较

表4 9种酿酒葡萄皮中9种花色苷的响应值Table 4 Chromatographic response value of nine anthocyanins in nine wine grapes

因目前市场上花色苷的对照品昂贵且不易购得，不能一一测定这9种花色苷的含量，本实验采用色谱图响应值（峰面积）对9种酿酒葡萄中的花色苷含量进行了初步比较，结果见表4。由表4可知，各种花色苷在各自葡萄中的含量各异，含量差别从1倍到8倍不等。如甲基花青素3-O-（6-O-对香豆酰）苷在蛇龙珠中的含量是晚红蜜葡萄中含量的1.03倍，而其在宝石葡萄中的含量则是马瑟兰葡萄中的7倍多；花翠素3-O-葡萄糖苷在西拉葡萄中的含量是品丽珠葡萄中含量的1.02倍，而其在晚红蜜葡萄中的含量则是马瑟兰葡萄中含量的8倍多。就花色苷总量（峰面积）而言，差别也在1.13倍到3.40倍不等。含量最高的是美乐（1.56×108），然后依次是宝石（1.50×108）、晚红蜜（1.35× 108）、蛇龙珠（1.25×108）、西拉（1.0×108）、赤霞珠（1.03×108）、品丽珠（6.49×107）、黑比诺（4.59×107）、马瑟兰（4.05×107）。

2.3.3 9种酿酒葡萄中4种花色苷的含量

根据对照品（花翠素3-O-葡萄糖苷、花青素3-O-葡萄糖苷、甲基花青素3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素3-O-葡萄糖苷）的标准曲线方程（见表2），分别对9种葡萄中的4种花色苷含量进行了测定，结果见表5。由表5可知，在称样量和处理条件相同的条件下，二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的含量最高的是美乐（43.03g/kg），然后依次是宝石（38.19g/kg）、晚红蜜（28.68g/kg）、蛇龙珠（28.43g/kg）、赤霞珠（21.63g/kg）、西拉（19.51g/kg）、品丽珠（14.76g/kg）、黑比诺（12.29g/kg）、马瑟兰（7.93g/kg）；结合表4中花色苷总含量发现，除赤霞珠和西拉顺序颠倒外，二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷含量高低顺序与花色苷总含量高低顺序完全一致。结果表明，二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷在酿酒葡萄中所占比例，在一定程度上可以体现出酿酒葡萄中花色苷总含量情况，在用花色苷评价酿酒葡萄品质优劣时其含量情况具有一定的代表性。

表5 9种酿酒葡萄皮中4种花色苷的含量Table 5 Content of the four anthocyanins in nine grapes g/kg

3 结论

利用超声波辅以涡旋振荡提取，利用高效液相色谱法对甘肃产区9种酿酒葡萄中的花色苷进行了分离检测，依据相关文献共定性检测了9种花色苷，利用相对百分含量、各自色谱峰响应值（峰面积）对9种酿酒葡萄中的花色苷进行了比较分析；利用现有4种花色苷对照品对酿酒葡萄中相应花色苷含量进行了定量计算。结果表明，9种酿酒葡萄中均以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷含量最高，占花色苷总含量的30%以上，其他花色苷因葡萄品种不同在花色苷总含量中所占比例各异；除黑比诺外，其他酿酒葡萄中花色苷种类相差无几，但含量方面有着较大的差异。从花色苷总含量的角度出发，对这9种酿酒葡萄进行排序，依次为美乐>宝石>晚红蜜>蛇龙珠>西拉>赤霞珠>品丽珠>黑比诺>马瑟兰。

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Determination of anthocyanins in different grape varieties in gansu region by HPLC

LI Qi,LI Guang*,JIN Liqiong,LUO Qingnan
(Analysis and Research Center of Gansu Province,Lanzhou 730000,China)

The nine kinds of anthocyanins were qualitatively detected by HPLC in the nine kinds of wine grapes(except Pinot Noir,only five kinds were detected).The relative percentage of the nine kinds of anthocyanins was compared,and result showed that malvidin-3-O-glucoside had the highest content in the 9 kinds of wine grapes,and other anthocyanins content depending on wine grape varieties.Comparative analysis of total anthocyanins was conducted refer to the total peak area.The anthocyanins content of different varieties in order was Merlot,Gems,Late Red Honey, Gernischt,Syrah,Cabernet Sauvignon,Cabernet Franc,Pinot Noir,Marselen.Meanwhile,the four kinds of anthocyanins in wine grape was quantitatively calculated with standard curve equation made by the reference substance of four anthocyanins,providing an important reference for grape quality evaluation on anthocyanins in Gansu region.

wine grape;anthocyanins;HPLC

TS262.6

A

0254-5071（2014）03-0132-05

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.03.032

2014-01-07

甘肃省科技重大专项计划（1102FKDA011）

李琪（1963-），男，副研究员，硕士，研究方向为葡萄酒及其他食品分析检测。

*通讯作者：李广（1981-），男，助理研究员，硕士，研究方向为葡萄酒及其他食品的分析检测。