乳酸菌蛋白降解及产香能力分析

苏媛宁，夏玉，林捷*，张锦鹏，张欢欢，曾繁祥，张俊华

（华南农业大学食品学院，广东广州510600）

乳酸菌蛋白降解及产香能力分析

苏媛宁，夏玉，林捷*，张锦鹏，张欢欢，曾繁祥，张俊华

（华南农业大学食品学院，广东广州510600）

研究了分离自新疆酸奶疙瘩中6株乳酸菌在37℃下蛋白质降解和产香能力。结果表明，6株乳酸菌稳定期活菌数均在108CFU/mL以上，且凝乳细腻，具有良好的组织状态。各菌株发酵性能有差异，干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌、乳脂乳球菌3株菌发酵性能较植物乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌发酵性能优，可用于不同风味和功能的发酵乳制品生产。其中，干酪乳杆菌具有良好的蛋白水解力，发酵15h，酪氨酸含量为594.33μg/mL；乳脂乳球菌产香性能好，发酵24h，丁二酮含量为12.32μg/mL、乙醛含量为59.27μg/mL，与其他菌株具有显著差异；瑞士乳杆菌具有强的产酸、产黏特性，发酵24h，酸度达159.76°T，黏度值1 389mPa·s。

乳酸菌；蛋白降解；丁二酮；乙醛

酸奶的风味与品质很大程度上取决于乳酸菌发酵剂[1]。风味良好，口感细滑，富含功能性多肽、具有保健功能的酸奶已经成为乳制品行业研究的热点。乳酸菌在代谢过程中产生乳酸、醋酸和醛、酮、醇、胞外多糖等物质，对酸奶的质地、风味及营养功能起着至关重要的作用[2-3]。另外，乳酸菌在发酵过程中能够水解乳蛋白生成小分子多肽，具有调节人体生理功能的功效[4-6]。在新疆传统乳制品酸奶疙瘩中分离出6株乳酸菌，经鉴定分别为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、乳脂乳球菌（Lactococcus lactis cremoris）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）、瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）。通过对6株乳酸菌发酵性能的测定，期望得到适合生产老酸奶的菌株。实验对6株野生乳酸菌的活菌数、产酸、产香、蛋白降解能力等方面进行研究对比，为开发具有自主知识产权，性能优良的发酵剂提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），简称Lp；乳脂乳球菌（Lactococcus lactis cremoris），简称Ls；嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus），简称St；保加利亚乳杆菌（Lactobacillusbulgaricus），简称Lb；干酪乳杆菌（Lactobacillus casei），简称Lc；瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus），简称Lh。以上菌种均由华南农业大学微生物实验室提供。

脱脂乳粉（蛋白质≥30%）：新西兰安佳。

邻苯二甲醛：天津市大茂化学试剂厂；丁二酮：天津市福晨化学试剂厂；三氯乙酸：天津市大茂化学试剂厂；碘：广州化学试剂厂；碘化钾：上海银典化工有限公司。所有试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HG303-5恒温培养箱：南京实验仪器厂；pHs-2F型pH计：上海精科仪器有限公司；SW-CJ-IFD型超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；DL-5低速大容量离心机：上海优浦科学仪器有限公司；UVmin-1240型分光光度计：岛津仪器有限公司；SNB-1型黏度计：上海方瑞仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵乳的制备工艺流程

脱脂乳粉复水（12%，w/v）→45℃水合30min→巴氏杀菌（85℃，5min）→冷却至40℃→接种3%活化单菌种→37℃恒温发酵→每3h取样，测定指标。

1.3.2 pH与滴定酸度的测定方法

采用精密pH计于室温条件下测定试样pH。滴定酸度按照GB5413.34—2010《乳和乳制品酸度的测定》方法进行测定。

1.3.3 活乳酸菌菌落数的测定

活乳酸菌菌落数的测定按照GB 4789.35—2010《食品微生物学检验乳酸菌检验》方法进行测定。

1.3.4 黏度的测定

采用黏度计进行测定。

1.3.5 乙醛含量的测定

取适量试样，与16%（w/v）三氯乙酸等体积混匀，静置10min，3 500r/min离心10min，取上清液用滤纸过滤。取滤液25mL于碘量瓶中，加入1%NaHSO3溶液5mL，摇匀，暗处放置1h。加入淀粉指示剂1mL，用0.1mol/L碘液滴定至接近无色，再改用0.01mol/L碘溶液滴定淡蓝色出现。加入1mol/L的NaHCO3溶液20mL，振荡混匀，用0.01mol/L碘标准溶液滴定至淡蓝色再次出现，记录消耗的碘液的体积[7]。同时做空白实验，平行3次。乙醛含量的计算公式：

式中：V1为碘标准溶液用量，mL；V2为空白实验碘标准溶液用量，mL；C为碘标准溶液的浓度，mol/L；25为乙醛样品称样量，mL；0.022为乙醛化学反应基本单元，g/mol。

1.3.6 丁二酮含量的测定

丁二酮标准曲线的制作：用微量进样器吸取15μL丁二酮标准品，用蒸馏水定容至500mL。取12支编号的试管分成2排放置，用蒸馏水准确配制质量浓度分别为0.0﹑3.0μg/mL﹑6.0μg/mL﹑9.0μg/mL﹑12.0μg/mL﹑15.0μg/mL丁二酮标准溶液。取10mL样液，第一排试管中加入1%邻苯二胺溶液0.5mL，第二排试管不加为空白；摇匀后置于黑暗处放置30min。后加入4.0mol/L盐酸终止反应，第一排试管加2.0mL，第二排试管加2.5mL，混匀后以第二排试管空白作为参比液，在波长335nm处测定吸光度值。做3个平行取平均值，以丁二酮质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标绘制标准曲线：y=0.097 8x-0.015 9，相关系数r2=0.998 6。

样品丁二酮含量测定：样品处理同1.3.5方法，滤纸过滤得上清液。取样液20mL置于50mL锥形瓶中，按上述丁二酮标准曲线步骤测定吸光度值。然后查丁二酮标准曲线可获得待测样品中丁二酮质量浓度[7-8]。

1.3.7 蛋白水解力的测定

酪氨酸标准曲线制作：用蒸馏水准确配制质量浓度分别为0、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1000μg/mL的酪氨酸溶液。用移液枪分别移取150μL不同质量浓度的酪氨酸溶液，加入3mL邻苯二甲醛（o-phthaldialdehyde，OPA）试剂[9]，混匀后室温条件下反应2min，在波长340nm处测定吸光度值。平行3次取平均值，以酪氨酸质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，制作标准曲线，得回归方程y=0.001x-0.009，相关系数r2=0.998。

样品测定[10]：吸取2.5mL的发酵乳于试管中，加入0.5mL蒸馏水，再加入0.75mol/L的三氯乙酸5mL，混匀，室温静置10min后，4000r/min离心5min。取上清液测定吸光度值，查标准曲线计算相当于酪氨酸的含量。

2 结果与讨论

2.1 各菌株的产酸特性

图1 不同乳酸菌发酵过程中酸度(A)及pH值(B)变化曲线Fig.1 Change of acidity(A)and pH(B)during fermentation by different lactic acid bacteria

由图1可知，各乳酸菌的产酸能力有一定的差异。发酵过程中，滴定酸度整体呈上升趋势，pH随时间延长呈下降趋势，发酵后期均趋于平稳。Lh产酸能力最强，发酵24h滴定酸度为159.77°T；Ls前期产酸速率较快，12h以后酸度缓慢上升，这与球菌生长速度快，属于先产酸类型相关[11]；发酵18h后，酸度增长趋于平缓，发酵后期，过高的酸度抑制活菌数的增长。但Lh与Ls在发酵乳的pH降至3.5左右仍能生长，说明2菌株具有强耐酸性，有利于肠道定植益生菌的开发。

2.2 各菌株的产香特性

乙醛和双乙酰是酸奶中主要的风味物质。由图2可知，乳酸菌的产乙醛和丁二酮含量随着发酵时间延长，含量逐渐上升，发酵后期，含量基本稳定，但菌种间存在差异。Ls菌株产香能力最强，发酵24h，乙醛含量可达59.27μg/mL，丁二酮含量为12.31μg/mL，与其他菌种存在显著性差异（P<0.05）。Lb产香性能较强，发酵24h，丁二酮产生量为8.19μg/mL。丁二酮的产生与pH和菌种的活力有关[12]，当pH下降至4.5左右，有大量的丁二酮开始积累，在发酵后期，由于菌种处于稳定及衰亡期，代谢活力较低和丁二酮的集聚，丁二酮含量保持在相对高且稳定的状态中。

图2 不同乳酸菌发酵过程中丁二酮含量(A)及乙醛含量(B)变化曲线Fig.2 Change of butanedione content(A)and acetaldehyde content (B)during fermentation by different lactic acid bacteria

2.3 乳酸菌的产黏特性

发酵乳的质地与胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）产生密切相关，王亚峰等[13]发现产胞外多糖乳酸菌能够提高发酵乳的黏度，减少乳清的析出，有助于改善发酵乳的组织状态和黏稠度。由图3可知，6株乳酸菌的产黏性趋势一致，发酵9h，凝乳时黏度显著上升，后期黏度趋于平缓，个别略有下降，可能与乳清析出相关。瑞士乳杆菌发酵乳黏稠性最好，发酵12h后黏度均达到1 369mPa·s。发酵24h，各乳酸菌的产黏特性的大小：Lh>Lc>Lb>Ls>Lp>St，且球菌的产黏能力普遍低于杆菌，这主要由于球菌生成乳酸速度过快，乳酸通过抑制乳酸脱氢酶的活性，从而抑制糖代谢，影响菌体的生长，胞外多糖产生量减少[14]。

图3 不同乳酸菌发酵过程中黏度变化曲线Fig.3 Change of viscosity during fermentation by different lactic acid bacteria

2.4 乳酸菌活菌数增殖速度

由图4可知，各乳酸菌发酵3h，已进入对数期；稳定期出现在12～18h之间，随后活菌数开始呈下降趋势。其中，Ls的活菌数一直保持较高的水平，发酵18h活菌数达到峰值1010CFU/mL；Lh、Lc、Lb和Lp的菌数差异不显著，稳定期菌数保持在109CFU/mL左右；St整个过程中，相对其他菌株，活菌数一直处于较低水平，发酵15h，活菌数低于108CFU/mL。

图4 不同乳酸菌发酵过程中活菌数变化曲线Fig.4 Change of viable bacteria during fermentation by different lactic acid bacteria

2.5 蛋白质水解能力

乳酸菌不能直接利用外源蛋白质和无机氮源，必须通过水解外源蛋白质或肽，提供菌体正常生长代谢对氨基酸的需要[15]，蛋白水解力的强弱与菌株的酶系相关[16]，影响菌体的正常生长。另外，适度的蛋白水解对改善制品风味以及生成活性多肽，具有重要作用。

由图5可知，在发酵12h前，各菌株发酵产生的酪氨酸呈曲折增长趋势。从乳酸菌的生长曲线可以看出，这个时期乳酸菌处于对数生长期，活力高，蛋白的水解能力强。Lc菌株蛋白水解能力最强，发酵15h，酪氨酸含量为594.33μg/mL；姜瞻梅等[17]研究中，筛选出具有强血管紧张素转换酶（angiotensin convertingenzyme，ACE）抑制活性与蛋白水解能力的菌株主要为瑞士乳杆菌。本实验中，瑞士乳杆菌发酵24h时，酪氨酸含量达383.5μg/mL，具有较好的蛋白水解能力，而St、Lp、Lb菌株对蛋白的降解能力保持在较低水平。

实验中生长力较强的菌株与蛋白水解力不呈正相关，说明菌株蛋白水解力高低与生长快慢并没有必然联系。

图5 不同乳酸菌发酵过程中酪氨酸含量变化曲线Fig.5 Change of tyrosine content during fermentation by different lactic acid bacteria

3 结论

实验中6株乳酸菌发酵脱脂乳，均具有良好的凝乳状态，但各菌株在产酸、产香、产黏性能，以及对蛋白的降解能力上存在显著差异。嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌与植物乳杆菌在各方面性能表现较低水平。瑞士乳杆菌具有良好的产酸、产黏能力，发酵24h，酸度达159.76°T，黏度值1389mPa·s。干酪乳杆菌具有强的蛋白水解能力，发酵15h，酪氨酸最高达594.33μg/mL，乳脂乳球菌产香性能最好，丁二酮、乙醛产生量显著高于其他菌株。综合各指标比较，瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、乳脂乳球菌发酵性能优，各有特色，适用于良好风味、富含活性多肽的功能性发酵乳制品开发，并提供了较全面的理论依据。

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Analysis of protein degradation and aroma-producing capacity of lactic acid bacteria

SU Yuanning,XIA Yu,LIN Jie*,ZHANG Jinpeng,ZHANG Huanhuan,ZENG Fanxiang,ZHANG Junhua
(College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510600,China)

Protein degradation and aroma-producing ability of six lactic acid bacteria strains isolated from yogurt pimple were determined in skimmed milk at 37℃.The result showed that the viable bacteria of six lactic acid bacteria was up to 108CFU/ml in stable phase and the curd was smooth with good organization state.The fermentation performance of each strain was different.The characteristics ofLactobacillus casei,Lactobacillus helveticus,Lactococcus cremoriswere better than other stains includingLactobacillus plantarum,Streptococcus thermophilus,Lactobacillus bulgaricus.The strains can be applied in fermented dairy products with unique flavor and special functions.L caseihad high hydrolysis efficiency and the tyrosine content was 594.33 μg/ml after incubation for 15 h.The aroma producing characteristic ofL.cremoriswas good,the content of butanedione was 12.32 μg/mL and the acetaldehyde content was 59.27 μg/mL after fermentation for 24 h,showing a significant difference with other strains.L.helveticusbehaved obvious characteristic of acidity and viscidity,the acidity reached 159.76°T and viscosity reached 1 389 mPa·s after fermentation for 24 h.

lactic acid bacteria;protein degradation;butanedione;acetaldehyde

TS252.1

A

0254-5071（2014）03-0036-04

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.03.010

2014-01-20

广东省科技攻关项目（2012B010300019）；2012年广东省大学生创新训练项目（1056412143）

苏媛宁（1991-），女，本科生，研究方向为食品科学与工程。

*通讯作者：林捷（1966-），女，副教授，硕士，研究方向为应用微生物与食品质量与安全控制。