分光光度法测定酶转化液中L-丝氨酸含量

冯志彬，陈国忠，张娟，察亚平，曹薇（鲁东大学生命科学学院，山东烟台264025）

分光光度法测定酶转化液中L-丝氨酸含量

冯志彬，陈国忠，张娟，察亚平，曹薇
（鲁东大学生命科学学院，山东烟台264025）

利用分光光度法测定酶转化液中L-丝氨酸含量。研究表明L-丝氨酸茚三酮缩合产物的最大吸收波长为510 nm，正丁醇、丙酮、水、氨水展开体系有利于分离前体物甘氨酸和产物L-丝氨酸，在此条件下得到吸光度与L-丝氨酸含量的线性关系，线性相关系数为0.999 1，方法检出限为0.061 2 g/L，平均回收率为100.9%，平均相对标准偏差为3.341%。与氨基酸分析仪相比，该法具有良好的相关性和准确的精密度，是一种简单、有效、快速的测定方法。

L-丝氨酸；甘氨酸；分光光度法；含量测定

L-丝氨酸是一种重要的药物，在氨基酸输液及多肽合成方面具有重要用途，同时作为中间物直接用于合成L-多巴、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-半胱氨酸等其他氨基酸，市场需求量日益提高[1-2]。目前L-丝氨酸主要以甘氨酸为前体通过生物酶法进行转化生产，建立一种适合L-丝氨酸和甘氨酸分离和定量测定的简便、快速的方法尤为重要[3-7]。目前较为常用的高效液相色谱法和氨基酸分析仪法因操作步骤复杂、仪器维护繁琐、价格昂贵，较难适应L-丝氨酸生产过程中的多样品、多频次的测定[8-11]。纸层析法分离氨基酸是一种微量而快速分离分析鉴定化合物的一种方法[12]。它是近代生化领域最为常用的快速、高效、灵敏的分离技术。该法操作简单、易于掌握、费用低、易于普及、分离效率高，能把各种性质极相类似的组分分离开来，非常适合在L-丝氨酸生产过程控制中应用[13-15]。国内学者[8，16]对纸色谱测定L-丝氨酸含量进行了研究，本实验在借鉴以往研究的基础上，采用新的展开剂进一步缩短了展开时间，并获得更好的分离效果，有利于L-丝氨酸的快速测定，对于指导L-丝氨酸工业生产过程的精确控制具有参考意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

L-丝氨酸、L-甘氨酸、茚三酮、正丁醇、丙酮、氨水、二乙胺、双圈层析三号滤纸：国药集团化学试剂有限公司。L-丝氨酸酶转化液：鲁东大学生命科学学院应用微生物研究室生产。

1.2 仪器与设备

7200分光光度计：优尼科（上海）仪器有限公司；氨基酸专用色谱工作站、UV200Ⅱ紫外可见波长监测器：美国Laballiance设备公司；SHA-B恒温振荡器：金坛市国旺实验仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

L-丝氨酸标准溶液：称取L-丝氨酸标准品1 g溶于水中，定容至100 mL容量瓶中，并置于冰箱中冷藏保存。

0.5 %茚三酮溶液：称取茚三酮标准品0.5g溶于丙酮中，定容至100 mL，现用现配。

展开剂：将正丁醇、冰醋酸、水、丙酮及氨水等溶剂按不同体积比例在棕色容量瓶中混合定容。

洗脱液：量取75mL无水乙醇加双蒸水定容至100 mL，称取0.5 g硫酸铜溶于水中定容至100 mL，冰箱保存，用时按38∶2的比例混合。

衍生剂：称取1 g 2,4-二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene，DNFB），溶于乙腈，定容至100 mL，现用现配。

衍生缓冲液：称取碳酸氢钠4.2 g，加双蒸水定容至100 mL，摇匀后备用。

定容缓冲液：称取磷酸二氢钾3.4g，加入0.1mol/LNaOH 145.5 mL，加双蒸水定容至500 mL。

1.3.2 分光光度法

酶转化液8 000 r/min离心5 min，上清液过0.45 μm滤膜，将滤液点样于层析三号滤纸，点样量2 μL，置于层析缸内，上行展开。待层析液上行至距滤纸顶端1.0 cm左右时，取出自然晾干后，均匀喷涂显色剂，置于95℃烘箱中显色10 min，将氨基酸显色斑点剪下后于25 mL比色管中，加5 mL洗脱剂洗脱20 min，得洗脱液，在7200分光光度计上测吸光度值[8]。

氨基酸标准曲线绘制：分析天平精密称取烘干至质量恒定的L-丝氨酸标样1 g，用去离子水溶解并定容至100 mL，再分别稀释配制成2 g/L、4 g/L、6 g/L、8 g/L、10 g/L的标准溶液，点样2 μL，层析显色后洗脱，于波长510 nm处测定吸光度值。以吸光度值A为横坐标，以L-丝氨酸质量浓度为纵坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程和相关系数。

1.3.3 氨基酸分析仪法

取经处理后的酶转化液1 mL，8 000 r/min离心20 min，取上清液过0.22 μm滤膜。准确量取过膜后的酶转化液液适量（相当于L-丝氨酸0.05 mmol）于50 mL棕色容量瓶中，加入已经配制好的衍生缓冲溶液5.0 mL，摇匀后再加入衍生试剂溶液5.0 mL，摇匀，将容量瓶置于60℃水浴中暗处恒温加热60 min后取出，放置待溶液冷却至室温后，加入定容缓冲液稀释至刻度并摇匀，放置15 min后可以开始进行色谱分离。色谱分离条件：氨基酸专用色谱ODS柱C18，5 μm，250 mm×4.6 mm，柱温：33℃；检测波长：360 nm；流动相总流量：1 mL/min。

2 结果与分析

2.1 吸收波长的检测

以双蒸水为参比液，在分光光度计上对洗脱液进行波长扫描，在波长510 nm处，L-丝氨酸洗脱液吸光度值最大，结果如图1所示。

2.2 展开剂的选择

由于L-丝氨酸的生产主要是利用甘氨酸为前体物，通过微生物酶转化生产[4]。所以酶转化液中既有L-丝氨酸又有甘氨酸，为获得L-丝氨酸和甘氨酸的最佳分离效果，需对展开剂进行选择，结果如表1、图2所示。

图1 L-丝氨酸标准品吸收光谱图Fig.1 Absorbance spectra of standard L-serine

表1 不同展开剂对L-丝氨酸和甘氨酸的分离效果Table 1 Separating effect of different developing solvent on the separation of L-serine and glycine

图2 纸色谱显色结果Fig.2 Paper chromatography results

由表1、图2可知，正丁醇-冰醋酸-水及正丁醇-丙酮-水体系为展开剂时，L-丝氨酸和甘氨酸的Rf值基本一致，未出现明显分离；正丁醇-丙酮（乙醇）-水-二乙胺展开体系能够分离甘氨酸和L-丝氨酸，但展开时间较长且Rf值差距不太明显；正丁醇-丙酮-水-氨水展开剂对L-丝氨酸和甘氨酸的分离效果最好，不仅层析斑点的Rf值较大，斑点之间的Rf值差距较大，而且两种氨基酸色斑的收敛性较好，没有明显的拖尾现象，呈圆形斑点，其中以正丁醇-丙酮-水-氨水比例为10∶15∶5∶2时效果最好。

2.3 标准曲线的绘制

L-丝氨酸标准曲线见图3。对空白5次测定的标准偏差SB=0.003 114，当测定信号≥3倍多次测定的空白标准偏差时（即A检测限：3SB），可以认为样品被检出。通过回归方程计算丝氨酸的最低检测质量浓度为0.061 2 g/L。

图3 L-丝氨酸标准曲线Fig.3 Standard curve of L-serine

2.4 加标回收率实验

在不同质量浓度的转化液中加入L-丝氨酸标准液2 g/L，测定转化液中L-丝氨酸含量，计算回收率，结果如表2所示，平均回收率都在100%左右，总平均回收率为100.9%，平均相对标准偏差（relative standar deviation，RSD)为3.341%，该法测定L-丝氨酸准确度及精密度较高，测量结果可靠。

表2 样品回收率测定(n=5)Table 2 Determination results of recovery rate(n=5)

2.5 纸层析萃取分光光度法和氨基酸分析仪法的比较

表3 纸色谱萃取分光光度法与氨基酸分析仪测定L-丝氨酸的比较（n=3）Table 3 Comparison of L-serine determination by paper chromatography extraction spectrophotometry and amino acid analyzer(n=3)

选取3个丝氨酸转化液样本分别采用纸色谱萃取分光光度法和氨基酸分析仪进行测定，与氨基酸分析仪测定相比，分光光度法检测样本的相对误差分别为1.39%、0.71%、1.22%，多次检测的相对误差均在5%以下，和氨基酸分析仪测定结果较为接近，RSD分别为4.041%、3.055%、3.606%，精密度高，重复性好，结果见表3。

3 结论

结果表明，展开剂中的正丁醇∶丙酮∶水∶氨水的体积比为10∶15∶5∶2时，L-丝氨酸和甘氨酸分离效果最好，不仅层析斑点不扩散且斑点之间的距离较大（即Rf值差值大），而且L-丝氨酸和甘氨酸的层析斑点没有拖尾现象，呈圆形斑点。该方法的线性方程为C=12.412A-0.054 5，相关系数R2=0.999 1，最低检测质量浓度为0.061 2 g/L，平均回收率为100.9%，RSD 3.341%。转化液样品前处理后采用本法测定L-丝氨酸含量获得了满意的检测结果，证明该方法符合L-丝氨酸生产过程中的测定要求。

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Determination of L-serine in enzyme conversion liquid by spectrophotometry

FENG Zhibin,CHEN Guozhong,ZHANG Juan,CHA Yaping,CAO Wei

(College of Life Science,Ludong University,Yantai 264025,China)

Determination of L-serine in enzyme conversion liquid was carried out by spectrophotometry.Results showed that the maximum absorbance wavelength of L-serine ninhydrin condensation products was 510 nm,and the compound of normal butanol,acetone,water and aqua ammonia developing agent is good for L-serine and glycine separation.The linear relationship between the absorption and the concentration of L-serine was obtained,and the linear correlation coefficient,detection limit,average recovery and relative standard deviation were 0.999 1,0.061 2 g/L,100.9%and 3.341%,respectively.Comparing to the amino acid analyzer,the method is simple,effective and quick,with good correlation and accurate precision.

L-serine;glycine;spectrophotometer;determination

O657.32

A

0254-5071（2014）07-0102-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.023

2014-05-17

山东省高等学校科技计划项目（J12LD02）

冯志彬（1977-），男，讲师，硕士，研究方向为发酵工程。